一种检测伏马菌毒素Ｂ１（ＦＢ１）的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析（ＴＲＦＩＡ）技术领域，用于对粮食，饲料以及食品中ＦＢ１含量的检测。本发明专利技术配制的试剂盒，采用ＴＲＦＩＡ检测ＦＢ１。微孔板包被有ＦＢ１－ＢＳＡ，加ＦＢ１标准或样品，再加ＦＢ１单克隆抗体。游离的ＦＢ１与微孔板上的ＦＢ１－ＢＳＡ竞争ＦＢ１单克隆抗体，没有连接的ＦＢ１单克隆抗体洗涤除去，加Ｅｕ３＋－羊抗鼠抗体，标记免疫反应后没有连接的Ｅｕ３＋－羊抗鼠抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度ｃｐｓ，荧光强度与样品中的ＦＢ１浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中ＦＢ１的含量。本发明专利技术提供的试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到０．０５ｎｇ／ｍＬ以上。
【技术实现步骤摘要】
—种检测伏马菌毒素Bl (FBI)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法，属 于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)
，用于对粮食，饲料以及食品中FBl含量的检
技术介绍
伏马菌素(Fumonisins)是国际上于1988年首次报道的主要由串珠镰刀菌产生的 一组新的真菌毒素，主要污染谷物，并在生长基质中繁殖代谢，产生多种真菌毒素。到目前 为止，已发现有II种结构类似物，其中伏马毒素BJFB》是伏马菌毒素的主要组分，约占毒 素总量的70%，是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。霉变玉米中总伏马菌毒素含量可高 达52. 670mg/kg。此外，大米、小麦、啤酒、牛奶等食品和饲料中也存在污染情况。伏马毒素 可导致马脑白质软化症，猪肺水肿综合症，对其他多种动物也会造成毒性作用及诱发肿瘤； 流行病学资料显示，人类膳食中FB工污染与食管癌高发有一定的关联。国际癌症研究中心 已把FB划分到2B组，即人类可能致癌物。因此为了保障人们的健康，开展食品中FB工的卫 生检测研究是很有必要的。 人类接触伏马毒素是相当普遍的，但是在不同的玉米种植区有不同的接触程度。 例如，尽管在美国、加拿大和西欧伏马毒素在玉米中同样发生，但在这些国家人们的消耗是 适度的。在非洲的部分地区，中南美洲和亚洲，一些人消耗大量的玉米面作为能量来源，而 这些地区的玉米污染伏马毒素是最高的。到目前为止，伏马毒素还没有一个广泛的限量标 准。2001年，美国食品与药物管理局(FDA)发布了食品(2mg/kg)、动物饲料(1 50mg/kg) 的FB1最高限量的指导性公告。欧盟相关的限量标准正在制定中。所以有必要积极开展高 灵敏FBI的检测手段的研究，以保障我国人民的食品安全。 目前伏马菌毒素Bl的测定方法有多种，如薄层色谱法TLC(灵敏度为500ng/g)， 高效液相色谱法HPLC(灵敏度为80ng/g)，液质联用技术(灵敏度100ng/g)，但由于费时、 灵敏度低、仪器设备昂贵、操作复杂且不适用于大批量样品检测等缺点，限制了其的推广应 用。酶联免疫测定法ELISA(灵敏度为5ng/g)，由于特异性强灵敏度高、操作简便、不需直接 接触毒素，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用，但检测的 灵敏度和试剂的稳定性还难以达到要求。 时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测 定技术。TRFIA原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端 和抗体分子上的自由氨基联接，制成Eu3+标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复 合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但实际上 这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancement solution)，使镧 系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的e-萘甲酰三氟丙酮(e-NTA)重新形成 微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测FBI的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测 方法，用于对粮食，饲料以及食品中FBI含量的检测。 本专利技术的技术方案一种检测伏马菌毒素Bl，简称FB1，的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，该试剂盒是由1、包被有FB1-BSA的96或48孔包被板，2、缓冲液，3、 FBI标准，4、FB1单克隆抗体冻干品，5、铕标记的羊抗鼠抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成。 缓冲液(2):含8mmol/L NaC1、0. 1 % BSA、0. 2%牛IgG、50 ii mol/L 二乙烯三胺五乙酸、0. lmL/L Tween-80禾P 0. 1% NaN3的pH7. 8、50mmol/L Tris—HCl溶液；6XFB1标准液(3) :1. OmL/瓶，标准液浓度为0， 1. 0， 10， 100， 500， 1000ng/mL。洗涤液(6):含14. 5mmol/L NaC1、0. 2mL/L Tween-80和0. 2 % NaN3的pH7. 8、50mmol/L Tris-HCl溶液。 增强液(7):每升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15iimoll3-萘甲酰三氟丙酮， 50 ii mol三正辛基氧化膦和lmL曲拉通X-IOO。 本专利技术主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测FB1。采用TRFIA的技 术有FBl-BSA活性包被板的制备、Eu3+标记抗体的制备、FBl标准品的制备、增强液的制备。 FB1-BSA活性包被板(1)的制备包被板包被固相抗原用pH 9. 6、50mmo1/ LNa2C03_NaHC03缓冲液将OTA-BSA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加 100iiL，4t:放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150iiL含3g/L BSA的上述缓冲液封闭， 4t:放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-2(TC冷冻保存。 铕标记的羊抗鼠抗体(5)的制备取溶解于pH 7.0、50mmol/L PBS的5g/L羊 抗鼠抗体l-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为pH 8. 5-9. 0、含0. 155mol麵Cl的 50mmol/L Na2C03-NaHC03缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊 抗鼠抗体至2g/L，取500-1000 y L稀释后的羊抗鼠抗体加入含O. 2_0. 4mg的Eu"-N2-_ 二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30 °C磁力搅拌反应16h，反应液经用pH 7. 8、80mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的1X40cm的S印hadex-G50柱层析，收集蛋白峰，稀 释、分装备用。 测定方法测定的基础是标记免疫反应。包被有FB1-BSA的微孔板，加入FBI标准 或已处理好的样品到各自的微孔中、再加入FB1单克隆抗体，振荡反应，游离的FB1与微孔 板上的FB1-BSA竞争FB1单克隆抗体，洗涤液洗涤，没有连接的FB1单克隆抗体在洗涤步骤 中被除去。加入Eu3+-羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的 ￡113+-羊抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧 光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的FBI浓度成反比，对照标 准曲线即可确定样品中FBI的量。 本专利技术的有益效果该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到 0. 05ng/mL以上。附图说明 图1 :检测伏马菌毒素B1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒示意图。1、包被有 FB1-BSA的96或48孔包被板，2、缓冲液，3、 FBI标准，4、 FBI单克隆抗体冻干品，5、铕标记 的羊抗鼠抗体，6、洗涤液，7、增强液。 图2 :FB1-TRFIA标准曲线图。具体实施例方式实施例l制备试剂盒和检测玉米样品 试剂盒提供的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下 (1). 1X96孔板(8条X12孔，可以拆分为单孔)包被有FB1-BSA。 (2). 6XFB1标准液，1. 0mL/瓶，标准液浓度为0， 1. 0， 10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测伏马菌毒素Ｂ１，简称ＦＢ１，的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征是：试剂盒由以下几个部分：包被有ＦＢ１－ＢＳＡ的９６或４８孔包被板（１），缓冲液（２），伏马菌毒素Ｂ１标准（３），伏马菌毒素Ｂ１单克隆抗体冻干品（４），铕标记的羊抗鼠抗体（５），洗涤液（６）和增强液（７）所组成； ＦＢ１－ＢＳＡ活性包被板（１）的制备：包被板（１）包被固相抗原：用ｐＨ ９．６、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ↓［２］ＣＯ↓［３］－ＮａＨＣＯ↓［３］缓冲液将ＯＴＡ－ＢＳＡ稀释至１０ｍｇ／Ｌ做为包被液，９６或４８孔微孔板各孔加１００μＬ，４℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加１５０μＬ含３ｇ／Ｌ ＢＳＡ的上述缓冲液封闭，４℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置－２０℃冷冻保存； 缓冲液（２）：含８ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．２％牛ＩｇＧ、５０μｍｏｌ／Ｌ二乙烯三胺五乙酸、０．１ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ－８０和０．１％ＮａＮ↓［３］的ｐＨ７．８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液； ６×ＦＢ１标准液（３）：１．０ｍＬ／瓶，标准液浓度为：０，１．０，１０，１００，５００，１０００ｎｇ／ｍＬ； 铕标记的羊抗鼠抗体（５）的制备：取溶解于ｐＨ ７．０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ的５ｇ／Ｌ羊抗鼠抗体１－２ｍＬ，经ＰＤ－１０柱转换缓冲条件，洗脱液为ｐＨ ８．５－９．０、含０．１５５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ↓［２］ＣＯ↓［３］－ＮａＨＣＯ↓［３］缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至２ｇ／Ｌ，取５００－１０００μＬ稀释后的羊抗鼠抗体加入含０．２－０．４ｍｇ的Ｅｕ↑［３＋］－Ｎ↓［２］－［ｐ－异氰酸－苄基］－二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，２８－３０℃磁力搅拌反应１６ｈ，反应液经用ｐＨ ７．８、８０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液平衡的１×４０ｃｍ的Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ５０柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用； 洗涤液（６）：含１４．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ－８０和０．２％ＮａＮ↓［３］的ｐＨ７．８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液； 增强液（７）：每升ｐＨ３．２邻苯二甲酸氢钾缓冲液含１５μｍｏｌβ－萘甲酰三氟丙酮，５０μｍｏｌ三正辛基氧化膦和１ｍＬ曲拉通Ｘ－１００。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄飚，张珏，王柯，周彬，陈蕴，金坚，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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