本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗伏马菌素单链抗体的筛选及其在伏马菌素免疫学检测方面的应用。直接从偶联的抗原FB1-KLH免疫的小鼠脾脏细胞出发，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、表达ELISA鉴定及序列测定，最后获得一个高亲和力的抗伏马菌素单链抗体及其编码基因，命名为FB-Mu?1H3。该单链抗体在大肠杆菌中进行大量表达纯化后可直接应用于伏马菌素的检测，包括在检测田间作物、饲料、粮食或食品伏马菌素污染中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种抗伏马菌素单链抗体的筛选及应用，与抗体筛选技术有关。
技术介绍
伏马菌素(Fumonisin)是上世纪80年代末发现的一种由串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)和多育镰刀菌(Fusarium proliferate)等真菌产生的水溶性霉菌毒素，是一类由不同多氢醇和丙三羧酸组成结构类似的双酯化合物。1988年Gelderblom首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马菌素。随后，Laurenf等在1989年又从伏马菌素中分离出伏马菌素Bl (FBI)和伏马菌素B2 (FB2)。伏马菌素是一组相关的极性代谢产物，到目前为止，已发现的伏马菌素有11种，分为A、B、C、P组，其中B组分布最广，毒性最强。伏马菌素Bl (英文简称FB1，下同)的产生菌串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)和多育镰刀菌(Fusarium proliferatum)等真菌为非专性、非宿主特异性的病原菌，能够污染玉米、高粱、小麦、水稻和豆类等粮食作物及某些饲料，因而伏马菌素的污染广泛存在于粮食作物的籽粒或饲料中。研究表明，伏马菌素能够引起多种动物疾病，如马脑白质软化症和猪肺水肿等。在大鼠、兔和羔羊等许多动物的急性实验中发现，伏马菌素具有肝毒性和肾毒性。伏马菌素的分子结构类似于动物体内的神经鞘氨醇 (sphingosine, So)和二氢神经鞘氨醇(sphinganine，Sa)等神经鞘脂类物质，可通过抑制神经鞘脂类的生物合成，导致动物组织、血、尿中二氢神经鞘氨醇/神经鞘氨醇(Sa/So)比值升高，促进细胞凋亡、干扰细胞生长和分化，具有明显的细胞毒性。伏马菌素还具有生殖毒性、胚胎毒性、免疫毒性和大鼠致癌性。因而伏马菌素的研究得到国际社会的广泛关注， 成为继黄曲霉毒素(Aflatoxin)之后新的研究热点。调查发现，FBl还可能是人类食管癌高发的诱因，在我国和南非部分食管癌高发地区玉米的FBl含量都高于低发区，国际癌症研究机构(International Agency ofResearch Cancer, IARC)将伏马菌素 Bl 列为 2B 类， 即可疑人类致癌物。另外，伏马菌素不能在动物体内分解成无毒的物质，能够通过鸡蛋、牛奶和动物组织等食物在人体内积累。因此，粮食和饲料作物中污染的伏马菌素严重威胁着食品安全及人畜健康，美国、欧盟等许多国家已经制定了伏马菌素在食品和饲料及其制品中的限量标准。鉴于FBl对食品安全的危害性，测定和调查其在玉米等粮食及其制品中的含量， 并对FBl污染进行风险性评估，规定食品和饲料中的限量标准，以保障人类的健康显得尤为重要。目前，伏马菌素的检测分析方法包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质谱联用法(GC-MQ、液-质谱联用法(LC-MQ和毛细管电泳法等，这些方法虽具较高的灵敏度和特异性，但需繁杂的提纯净化步骤和较贵重的仪器设备，不易推广使用。而应用ELISA等免疫学检测方法，则具备简单、快速、灵敏的特点，可同时检测大量样品，因而受到各国学者的重视。目前，国外报道的用于伏马菌素免疫检测的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和单链抗体，而国内报道的都是通过杂交瘤融合细胞筛选得到的单克隆抗体。多克隆和单克隆抗体的制备都需要涉及动物，而且多克隆抗体的特异性较差，单克隆抗体筛选需要专门的细胞培养设备，细胞保存需要专门的超低温保存设备，生产过程耗时费力，成本高。国外报道的有两篇关于抗伏马菌素单链抗体的制备的文献，^iou等(1996)分别通过噬菌体展示筛选免疫抗体基因文库和杂交瘤细胞转化获得单链抗体(Zhou, H. R. ；Pestka, J. J. ；Hart, L. P. Molecular cloning andexpression of recombinant phage antibody against fumonisin Bi.J.Food Prot.1996,59, 1208-1212.)，但其免疫小鼠和筛选抗体所用抗原为偶联的FBl-BSA和FB1-0A，与本专利技术所用抗原不相同，抗体筛选方法和过程差别较大，且文章中说明得到的单链抗体亲和力较低，需要进一步改善其亲和力后才能够用于伏马菌素检测；Lauer等Q005)通过噬菌体展示筛选抗体基因文库得到抗FBl的单链抗体可用于伏马菌素检测(Lauer，B. ；Ottleben, I. ；Jacobsen, H, J. ；Reinard, T. Production of a single-chain variable fragment antibodyagainst fumonisin Bi. J. Agric. Food Chem. 2005，53，899—904.)，但其抗体基因来源为人工合成的抗体基因文库，完全不同于本专利技术构建的免疫抗体基因文库。更重要的是，这两篇国外报道的文献虽获得了抗伏马菌素的单链抗体，但并未公布其核苷酸或氨基酸序列，而且国内市场上也未有相关检测产品出售。因此，本专利技术通过构建免疫抗体基因文库，利用噬菌体抗体库技术筛选获得抗伏马菌素单链抗体，可为检测和调查粮食作物及其制品中伏马菌素的污染情况提供可靠有效的检测手段。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有检测技术存在的缺陷和不足，利用噬菌体抗体库技术获得一种抗伏马菌素单链抗体，用于镰刀菌菌株本身产生的毒素以及粮食、饲料或食品中伏马菌素污染的免疫检测，为保障食品安全提供可靠有效的检测手段。本专利技术是这样实现的直接从偶联的抗原FBl-KLH免疫的小鼠脾脏细胞出发，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、表达ELISA 鉴定及序列测定，最后获得一个高亲和力的抗伏马菌素单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为FB-Mu 1H3，该单链抗体基因可在大肠杆菌中进行可溶性表达。本专利技术的抗伏马菌素单链抗体由819个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1 所示。本专利技术的抗伏马菌素单链抗体由272个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 2 所示。本专利技术的抗伏马菌素单链抗体主要由抗体重链可变区Vh、抗体轻链可变区\和连接肽组成，抗体重链可变区Vh和抗体轻链可变区\通过连接肽(Gly4 Ser)3连接共同完成伏马菌素的识别和结合。本专利技术的抗伏马菌素单链抗体的重链可变区Vh由363个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 3所示。本专利技术的抗伏马菌素单链抗体的重链可变区Vh由121个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO 4所示。本专利技术的抗伏马菌素单链抗体的抗体轻链可变区\由327个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 5所示。本专利技术的抗伏马菌素单链抗体的抗体轻链可变区\由109个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 6所示。本专利技术的抗伏马菌素单链抗体在大肠杆菌中进行大量表达纯化后可直接应用于伏马菌素的检测，所述的应用包括在检测田间作物、饲料、粮食或食品伏马菌素污染中的应用，也可以作为在制备ELISA检测试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果1、本专利技术的有益效果之一是利用噬菌体抗体库技术，构本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉才，李和平，胡祖权，张静柏，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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