一种异土木香内酯的提纯制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用技术

本发明专利技术公开了一种异土木香内酯的提纯制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。本发明专利技术方法包括以下步骤：土木香为原料，用９０－９９％的乙醇冷浸提取，滤液减压浓缩得浸膏；将浸膏悬浮在饱和的盐水中，在６０～９０℃条件下，用石油醚萃取３次，合并石油醚萃取液，并用无水Ｎａ↓［２］ＳＯ↓［４］脱水后减压浓缩至近干，分别得石油醚提取物；采用硅胶柱色谱进行分离，石油醚－乙酸乙酯溶剂系统进行梯度洗脱，依次用乙酸乙酯、甲醇冲柱至洗脱完全，洗脱液按体积接收，每份５００ｍＬ，减压浓缩各流份将相同流份，进行合并；在８－１９流份得化合物异土木香内酯。本发明专利技术方法制备的异土木香内酯其纯度高、晶型好、产量大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种化合物的提纯制备方法和其医药用途，具体地说是一种异 土木香内酯的提纯制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
土木香为菊科土木香(Inulahelenium L)的干燥根。土木香根中含有1-3% 的挥发油，油中的主要成分为十木香内酯、异土木香内酯、二氢土木香内酯等。 在传统医学中，土木香的功能主要为健脾和胃，行气解郁，止痛安胎。临床上 主要用于治疗胸腹胀满疼痛，呕吐泄泻，痢疾，胎动不安。现代药理学研究已 确认土木香挥发油具有抗菌，驱虫，镇痛，影响平滑肌、心血管的作用。在传 统医学应用中，土木香的提取物通常为混合物，故其疗效不确切，毒副作用大。 例如，土木香挥发油所含的土木香内酯及其衍生物均易溶于醇，故其提取物不 纯且副作用多(详见中国医学科学院药物研究所等.中药志(第一册)〔M)北京 人民卫生出版杜，1979， 86)。因此，长期以来人们一直都在致力于寻找更好的 土木香有效成分的提纯制备方法，同时也在积极探索土木香有效成分的新医药 用途。 .
技术实现思路
本专利技术的目的就是耍提供一种异土木香内酯的提纯制备方法，同时提供一 种异土木香内酯的新的医药用途。 本专利技术的目的是这样实现的本专利技术所提供的异土木香内酯的提纯制备方法，包括以下步骤(a) 以菊科旋覆花属植物土木香为原料，用90-99%的乙醇冷浸提取，过滤， 滤液减压浓縮得浸膏；(b) 将浸膏悬浮在饱和的盐水中，使其浓度达到0.8—1.2g/ml，在60 9(TC 条件下，用石油醚萃取3次，萃取溶剂体积分别为相当于水溶液体积的2/3， 1/2，1/3，合并石油醚萃取液，并用无水Na2S04脱水后减压浓縮至近干，分别得石油 醚提取物；(c)采用硅胶柱色谱进行分离，石油醚-乙酸乙酯溶剂系统进行梯度洗脱， 洗脱液配比为10:1， 8:2， 6:4， 5:5，最后依次用乙酸乙酯、甲醇冲柱至洗脱 完全，洗脱液按体积接收，每份500 mL，减压浓縮各流份，采用薄层色谱进行 检测，按照薄层色谱结果将相同流份进行合并；在8-19流份得化合物异土木香 内酯。本专利技术方法中所用的倍半萜化合物异土木香内酯，其化学结构如下其波谱数据为'H-NMR 5 ppm: 6.13 (1H, br. s, H-13a)， 5.59 (1H, br. s， H-13b), 4.77 (1H, br. s, H陽15a)， 4.44 (1H, br. s， H陽15b), 4.50 (1H， br. S， H-8), 2.99 (1H, m, H-7), 2.34 (1H, d， ■/= 12.0 Hz, H-3b), 2.20 (1H， d, J= 16.0 Hz， H-9a), 2.01 (1H, m, H-3a)， 1.85 (1H, J= 12.5 Hz, H-5)， 1.75 (1H, o. m, H-6a), 1.71 (1H, o.m, H-9b), 1.60(2H, o.m, H-2)， L54 (1H, o.m， H-la), 1.40 (1H， m, H-6b), 1.25 (1H， m, H-lb), 0.83 (3H, s， 14-CH3)。 13C-NMR 5 ppm: 41.33 (C-l), 22.68 (C陽2), 36.79 (C-3)， 148.97 (C-4), 46.18 (C-5), 27.45 (C-6), 40.51 (C-7), 76.82 (C-8)， 42.16 (C-9), 34.26 (C-10), 142.16 (C-ll)， 170.67 (C-12), 120.18 (C-13), 17.65 (C-14)， 106.61 (C-15)。 本专利技术方法制备的异土木香内酯其纯度高、晶型好、产量大。 试验表明，采用本专利技术方法提纯制备异土木香内酯，其纯度可达80-97%, 产品收率与一般的醇提法相比可提高2-3倍。本专利技术人经过长期大量的研究还发现丫异土木香内酯的新的药理活性，从 而完成了异土木香内酯在制备抗肿瘤药物中的应用的专利技术目的。本专利技术所述异土木香内酯尤其适于在制各抗消化道肿瘤药物中应用。特别是在制备抑制消化道肿瘤细胞增殖药物中的应用。本专利技术所述异土木香内酯的新的药理活性通过以下试验得到了验证。 试验用细胞株HeLa:人子宫颈癌细胞株;HEC-1:人子宫内膜癌细胞株；SHIN-3和HOC-21: 人卵巢透明癌细胞株；HAC-2:人卵巢囊腺癌细胞株；T-98和U251-SP:人脑 神经胶质瘤细胞株；HLE:人肝癌细胞株；MM 1-CB和HMV-1:人黑色素瘤细 胞株；KT:脑转移细胞株。(一)异土木香内酯抑制肿瘤细胞增殖活性试验实验方法细胞增殖实验法。在含有20%胎牛血清的D-MEM/hams培养基中，将被试细胞调成密度为2 Xl()S细胞/mL。将上述肿瘤细胞株悬液接种于96孔培养板，每孔50|il，分别加 入空白对照磷酸盐缓冲液(PBS)、溶剂对照0.1 %二甲基亚砜、阳性对照顺铂(DDP) 以及不同浓度单体化合物各5(^1，每组均设3个复孔。置于饱和湿度、37。C和 5%C02培养箱中培养48小时，于培养结束前4小时，各培养孔加入5mg/ml四 氮唑盐(MTT)lO!il，培养结束后，弃去培养上清，悬浮细胞需离心后弃去上清， 每孔加入反应停止液150^1，静置1小时，用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度(OD) 值，测定波长A:570nm，参考波长入630nm，并计算肿瘤细胞生存率。本专利技术化合物溶解于DMSO，添加后的最终浓度在0.1%以下。以只添加 DMSO的培养基作为对照。试验结果本专利技术化合物的抑制肿瘤细胞增殖活性以相对于对照(添加DMSO)的结 果在下表l、表2中表示。表1异土木香内酯抗妇科肿瘤细胞增殖活性<table>table see original document page 5</column></row><table>表2异土木香内酯抗其它肿瘤细胞增殖活性异土木香内酯 抑制细胞增殖活性(％)浓度((iM)T-98U25卜SPHLEMM1-CBHMV-1KT100567164788563104229142720122601224(二)异土木香内酯抑制体内移植肿瘤细胞增殖活性试验 实验方法体内移植肿瘤细胞实验法。取冷冻保存的腹水型肉瘤S180和腹水型肝癌H22细胞，2000 r/min离心5 min，弃上清液，用无菌生理盐水稀释，调整瘤细胞至2X106细胞/mL;取5只 健康昆明种小鼠，每只用上述细胞悬液0.4 mL，腹腔注射，7 10天后接种小 鼠腹部明显增大，凸出。将其麻醉处死，无菌抽取乳白色腹水液，以生理盐水h 1稀释后计算活细胞数>95%，调整瘤细胞密度为2X106细胞/mL，待用。将腹腔传代的肝癌细胞(H22)及肉瘤细胞(S，)接种部位于小鼠右前肢腋下，接种量为2><106细胞/只，分别灌胃给予自来水，腹腔给予环磷酰胺(30mg/kg)，灌胃给予各浓度的异土木香内酯(100mg/kg， 10mg/kg和lmg/kg)，各处理组的给药溶剂为0.2mL/10g体重，连续给药10天。.于给药的第IO天，脱颈椎处死小鼠，立即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异土木香内酯的提纯制备方法，其特征在于它包括以下步骤：　（ａ）以菊科旋覆花属植物土木香为原料，用９０－－９９％的乙醇冷浸提取，过滤，滤液减压浓缩得浸膏；　（ｂ）将浸膏悬浮在饱和的盐水中，使其浓度达到约０．８－１．２ｇ／ｍｌ， 在６０～９０℃条件下，用石油醚萃取３次，萃取溶剂体积分别为相当于水溶液体积的２／３，１／２，１／３，合并石油醚萃取液，并用无水Ｎａ↓［２］ＳＯ↓［４］脱水后减压浓缩至近干，分别得石油醚提取物；　（ｃ）采用硅胶柱色谱进行分离，石油醚－乙 酸乙酯溶剂系统进行梯度洗脱，洗脱液配比为１０∶１，８∶２，６∶４，５∶５，最后依次用乙酸乙酯、甲醇冲柱至洗脱完全，洗脱液按体积接收，每份５００ｍＬ，减压浓缩各流份，采用薄层色谱进行检测按照薄层色谱结果将相同流份进行合并；在８－１９流份得化合物异土木香内酯。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丛斌，史清文，董玫，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]