本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定无机磷（磷酸根）浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶Ａ、过氧化氢、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度，从而测算出无机磷（磷酸根）的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测 定无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡， 血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆 中、浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积 为35——40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，〉70时， 可发生转移性钙化。当乘积<35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶 解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆、 的恒定，主要受维生 素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐 阴离子(H2P04"， HPO420。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合 法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定 性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是 比色法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离 子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定 的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二 醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物，4方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做 标本空白，否则结果偏高。酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性 范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还 原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的 方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全6动生化分析仪上进 行无机磷(磷酸根)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实 的推广应用。本专利技术无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶—氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+辅酶A十氧丙酮酸+ 二氧化碳+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)苹果酸+辅酶这种方法应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC4丄1.31)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、苹果酸脱氢 酶(malate dehydrogenase (decarboxylating); EC 1.1.1.38 EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC1丄1.40; EC1丄1.83)酶促反应比色法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解无机 磷(磷酸根)反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢 酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶〔在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过 测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算无机磷(磷酸根)的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是二剂，如下成分关系的本专利技术无机磷(磷酸根)诊断/测定试 剂盒较为理想缓冲液 稳定剂 还原型辅酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶丙酮酸氧化酶苹果酸脱氢酶草酰乙酸乙酰辅酶A过氧化氢100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L 12 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L本专利技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、 苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、过氧化氢。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、过氧化氢。 试剂2缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸 脱氢酶。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草 酰乙酸、乙酰辅酶A、过氧化氢在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒口丄 以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、过氧化氢。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式内酮酸羧化酶。 还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草 酰乙酸、乙酰辅酶A、过氧化氢在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直 接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，其 还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。具休实施方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L丙酮酸氧化酶 8000 U/L苹果酸脱氧酶 草酰乙酸 乙酰辅酶A 过氧化氢10000 U/L 12 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与 试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟 左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大 小。实施例二本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 草酰乙酸 乙酰辅酶A 过氧化氢 试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L丙酮酸氧化酶 8000 U/L苹果酸脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）浓度测定方法，其方法原理如下： 磷酸根＋草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳＋磷酸烯醇式丙酮酸＋水 二氧化碳＋过氧化氢＋乙酰辅酶Ａ 丙酮酸氧化酶 丙酮酸＋辅酶Ａ＋氧 丙酮酸 ＋二氧化碳＋还原型辅酶 苹果酸脱氢酶（脱羧化） 苹果酸＋辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度，测算出无机磷（磷酸根）的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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