本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定无机磷（磷酸根）浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度，从而测算出无机磷（磷酸根）的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定 无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡，血 中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆中钙]、 浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积为35—— 40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，>70时，可发生转 移性钙化。当乘积<35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成 骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆、 [P加勺恒定，主要受维生素D，甲状旁 腺激素及降钙素的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴 离子(H2P04"， HP04"。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合法， 酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定性方 法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色 法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子 型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定的 还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇 基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做标 本空白，否则结果偏高。酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范 围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原 型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的力、法， 同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采 用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷(磷 酸根)浓度测定，向且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本专利技术无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶/^~腺苷三磷酸+丙酮酸氨+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶丙氨酸+水+辅酶 这种方法应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4丄1.31)酶(偶)联丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase; EC 2.7.1.40 )、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase; EC1.4丄1)酶促反应比色法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解无机 磷(磷酸根)反应产生磷酸烯醇式丙酮酸，再通过(偶)联合丙酮酸激酶、丙氨 酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在 340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nrn处吸光度下降的程度， 通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算无机磷(磷酸根)的浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒 较为理想缓冲液 稳定剂 还原型辅酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸激酶草酰乙酸 腺苷二磷酸氯化铵 氯化钾100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L 12 mmol/L 10 mmol/L 9 mmol/L 3 mmol/L本专利技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、 丙氨酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾。试剂2缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、草酰乙6酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，其还 原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。 具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L丙酮酸激酶 8000 U/L7丙氨酸脱氢酶 10000 U/L草酰乙酸 12mmol/L 腺苷二磷酸 10 mmol/L氯化铵 9 mmol/L氯化钾 3 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加 入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右， 检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。 实施例二本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100謹ol/L稳定剂50 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L草酰乙酸12 mmol/L腺苷二磷酸10 mmol/L氯化铵9 mmol/L氯化钾3 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmd/L稳定剂500 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000 U/L丙酮酸激酶8000 U/L丙氨酸脱氢酶10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）浓度测定方法，其方法原理如下： 磷酸根＋草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳＋磷酸烯醇式丙酮酸＋水 腺苷二磷酸＋磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶／Ｋ↑［＋］ 腺苷三磷酸＋丙酮酸 氨＋丙酮酸＋还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 丙氨酸＋水＋辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度，测算出无机磷（磷酸根）的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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