本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定无机磷（磷酸根）浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶Ａ、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在４００－７００ｎｍ波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出无机磷（磷酸根）浓度的大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定无 机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡，血 中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆中、 浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积为35——40。 当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，>70时，可发生转移性 钙化。当乘积<35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用， 引起佝偻病或软骨病。血浆、 的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降 钙素的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴离 子(H2P04"， HP042—)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合法，酶 法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定性方法是 同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子型 表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定的还原 剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基 醚(TritonX-lOO)最理想。磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物， 方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范围 内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成卩引嗒胺色原 (Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400—700nm波长处吸 光度的上升，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以 实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分 析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷(磷酸根)浓度测定，而且测定速度快、 灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本专利技术无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+辅酶八+氧丙酮酸氧化酶过氧化氢+ 二氧化碳+乙酰辅酶A过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水 这个方法应用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC6.4丄1)(偶)联丙酮酸氧化酶 (pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、及过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11.1.7)酶促反应终点比色法。丙酮酸羧化酶酶解无机磷(磷酸根)反应产生丙酮酸，再通过(偶) 联合丙酮酸氧化酶、过氧化物酶的作用，最后生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用 下，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器， 在400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大小； 通过测量400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的程度， 得出无机磷(磷酸根)浓度大小测定结果。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分 关系的本专利技术无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液函mmol/L稳定剂500 mmol/L过氧化物酶30000 U/L丙酮酸羧化酶10000 U/L丙酮酸氧化酶12000 U/L腺苷二磷酸8 mmol/L草酰乙酸12 mmol/L辅酶A4 mmol/L还原型色原体组合0.1-20 mmol/L所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合:3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3_甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基~■N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4- 双氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒3.5- 双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2'-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本专利技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷二磷酸、草酰 乙酸、辅酶A、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A。 试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、过氧 化物酶。还原型色原体组合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷二磷酸、 草酰乙酸、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂110缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A 。 试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶。 还原型色原体组合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 具体实施例方式下面结合实施例子对本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）浓度测定方法，其方法原理如下： 磷酸根＋腺苷二磷酸＋草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸＋丙酮酸＋二氧化碳 丙酮酸＋辅酶Ａ＋氧 丙酮酸氧化酶 过氧化氢＋二氧化碳＋乙酰辅酶Ａ 过氧化氢＋ 还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亚胺色原＋水 将最终反应物置于可见光分析仪下，检测４００－７００ｎｍ处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收程度，得出无机磷（磷酸根）浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。