本发明专利技术公开了一种制备辅酶Ｑ↓［１０］的方法。本发明专利技术所提供的制备辅酶Ｑ↓［１０］的方法，是将粟酒裂殖酵母菌接入含有茄尼醇的培养基中，在温度为２５－３５℃、压力为５－２０ＭＰａ的超临界ＣＯ↓［２］的环境中进行发酵，得到辅酶Ｑ↓［１０］。本发明专利技术方法充分利用超临界ＣＯ↓［２］的溶解特性增加茄尼醇的溶解度，有效降低转化过程中的产物抑制作用，且给酵母提供了高厌氧环境，改变了微生物的呼吸链供氧方式，从而促进了辅酶Ｑ↓［１０］的合成；而且本发明专利技术方法中添加了茄尼醇作为辅酶Ｑ↓［１０］合成的底物，提高了辅酶Ｑ↓［１０］合成的速度及产量。实验结果表明，采用本发明专利技术方法制备得到的辅酶Ｑ↓［１０］产量比一般发酵方法提高６０％－１６２％。
Method for preparing coenzyme Q10 by microbial transformation under supercritical CO2
The invention discloses a method for preparing coenzyme Q: 10. Preparation method of coenzyme Q: 10 provided by the invention of the medium containing yeast Schizosaccharomyces access solanesol, fermentation temperature 25 to 35 DEG C and the pressure of 5 20MPa supercritical CO: 2 environment, coenzyme Q is obtained: 10. 2 the dissolution characteristics of the method of the invention is to make full use of supercritical CO:, increase the solubility of solanesol, effectively reduce the inhibition in the process of transformation, provides high anaerobic environment and yeast, change of respiratory chain oxygen microorganism, thus promoting the synthesis of coenzyme Q: 10; and the method to add solanesol as coenzyme Q: 10 synthesis of substrate, improve the speed and yield of coenzyme Q: 10 synthesis. The experimental results show that the coenzyme Q prepared by the method of the invention, the lower the yield increased 10 than the general 60%162% fermentation method.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种制备辅酶Qh)的方法，特别涉及一种在超临界C02条件下微生物转化制备辅酶Qu)的方法。
技术介绍
超临界C02作为一种反应和萃取介质，条件温和，有较大的扩散系数，溶解能力和介电常数对温度和压力敏感，且无毒、不燃、经济，不产生溶剂残留，因此可以作为酶催化反应良好的反应介质。辅酶Qu)由于其特殊的生理生化功能而被广泛应用于临床、保健等领域，近几年随着对其研究的深入，其应用领域、需求量等都在扩大。目前生产辅酶Qu)的方法主要有组织提取法、化学合成法和微生物发酵及转化法。前两种由于原料和成本条件限制而未被广泛应用，微生物转化法因反应条件温和、速度快且底物无毒无害而备受关注，但不足之处在于易受产物抑制而降低产量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备辅酶Qw的方法。本专利技术所提供的制备辅酶Qw的方法，是将粟酒裂殖酵母菌接入含有茄尼醇的培养基中，在温度为25-35°C、压力为5-20MPa的超临界C02的环境中进行发酵，得到辅酶Q1Q。其中，接入所述培养基的粟酒裂殖酵母菌和所述茄尼醇的配比可以为茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的湿菌重=(10-50) rag: lg。接入所述培养基的粟酒裂殖酵母菌与所述培养基的质量配比可以为粟酒裂殖酵母菌的湿菌重培养基=1:(1-4)。上述粟酒裂殖酵母菌和所述茄尼醇的配比具体可以为茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的湿菌重=10 mg: lg。上述粟酒裂殖酵母菌与所述培养基的质量配比具体可以为粟酒裂殖酵母菌的湿菌重培养基=1: 4。上述培养基可以为任一种可以培养粟酒裂殖酵母菌的培养基。所述超临界co2的温度具体可以为3rc。3所述发酵的时间可以为8-24h。所述发酵的时间具体可以为20h。所述发酵结束后，以0.2-0. 5MPa/min的速度卸压。本专利技术方法利用超临界C02的扩散系数高及溶解能力良好的特点，以增加辅酶Q^前体——茄尼醇的溶解度，另外，由于辅酶Qu)不易溶于水，在常规发酵条件下克服产物抑制的方法有限，而超临界C02可通过改变温度和压力而具有溶解辅酶Q1Q的能力。因此本专利技术方法充分利用超临界C02的溶解特性增加茄尼醇的溶解度，有效降低转化过程中的产物抑制作用，且给酵母提供了高厌氧环境，改变了微生物的呼吸链供氧方式，从而促进了辅酶Qm的合成；而且本专利技术方法中添加了茄尼醇作为辅酶Qu)合成的底物，提高了辅酶Qw合成的速度及产量。实验结果表明，采用本专利技术方法制备得到的辅酶Qu)产量比一般发酵方法提高60%-162%。附图说明图1为辅酶Q,。标准品HPLC图谱。图2为样品中辅酶QwHPLC图谱。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。实施例1、超临界C02条件下微生物转化制备辅酶Qu)一、菌的培养将粟酒裂殖酵母菌(6: p/^^，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，产品目录号2. 1794)接种到斜面活化培养基上，恒温培养箱中28。C培养24h，再接种到50ml液体活化培养基中，28。C摇床培养18h，摇床转速为200r/min，然后以10%的接种量接种到5个分别盛有100ml发酵培养基的250ral三角瓶中，在200r/min的转速下、28"C摇床培养18h，至对数生长期末期。斜面活化培养基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物1%， pH6.0，琼脂2%，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。液体活化培养基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物1%， p服.O，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。发酵培养基葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，MgS041.0g/L ， K2HP04 3H20 1. Og/L ， KH2P041. Og/L，其余为水，pH5. 0。 121°C灭菌15min。二、 超临界C02条件下利用粟酒裂殖酵母菌制备辅酶Q,。将步骤一得到的发酵液离心(3000g， 10min)，收集菌体并用质量浓度为0. 85%生理盐水洗涤两遍，离心后称量湿重。(本实验采取的湿重的测定方法为将细胞离心(3000g， 10min)后，倒去上清液后在滤纸上倒置2min后称重。)取一定质量的菌，将其接入4倍于湿菌菌体质量的发酵培养基中，同时加入茄尼醇，使茄尼醇与菌体的湿菌重配比为茄尼醇菌体湿菌重40mg : lg;然后将反应体系放入超临界C02装置中，调整温度为3rC，压力升至9MPa，保持该压力和温度下转化20h后，以0. 25MPa/min的速度卸压。以未经超临界C02作用且未添加茄尼醇的转化体系和经超临界C02外场作用但未添加茄尼醇的转化体系作为对照。三、 辅酶Qw的提取及检测1、 提取方法步骤二的转化反应结束后，将菌体离心(3000g， 10min)，收集菌体，分离上清，收集的菌体用质量浓度为0.85%的生理盐水洗涤两遍，菌体悬浮于25ml磷酸缓冲液(pH5. 0)30min，加入38 u 1巯基乙醇，于摇床中作用3h(37。C，200rpm)，然后加入蜗牛酶(拜尔迪生物技术公司)作用lh (其中湿菌重与蜗牛酶质量配比为100: 3)，超声波粉碎仪在冰浴条件下破碎细胞(超声条件超声功率为500w，超声60次，超声时间5s，间隔时间6s)，加入等体积(约25ml)石油醚萃取，取上层，用去离子水洗至中性，无水硫酸钠脱水至澄清，氮吹浓縮干燥(37'C水浴)，加入10ml无水乙醇清洗，收集清洗液，4X:冰箱冷析，除去固醇等杂质，过0.45um滤膜，待测。2、 检测方法色谱柱为Spherisorb C18fe， 150mmX4.6mm， 5ym，色谱柱填充料为十八烷基硅烷键合硅胶，柱温22-23°C。采用无水乙醇水(98: 2)为流动相，流速为lml/min，进样量20 u 1，检测波长为275nm。标准品辅酶Qu)的保留时间为12. 408min，样品中辅酶Q!。保留时间为12. 039min。标准品和样品的图谱分别如图1和图2所示。实验设3次重复，结果取平均数。样品中辅酶Qu)的峰面积分别为1066.63、1054.72、 1037.86。结果测得辅酶Qi。产量为0. 41mg/g(湿菌重)，比对照未经超临界C02作用且未添加茄尼醇的方法产量增加了 161.8%，比经超临界C02外场作用但未添加茄尼醇的方法提高了 128. 4%。实施例2、超临界C02条件下微生物转化制备辅酶Q1Q一、 菌的培养将粟酒裂殖酵母菌(5: proz^，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，产品目录号2. 1794)接种到斜面活化培养基上，恒温培养箱中35i:培养20h，再接种到50ml液体活化培养基中，35。C摇床培养24h，摇床转速为250r/min，然后以5%的接种量接种到5个分别盛有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在250r/min的转速下、35。C摇床培养24h，至对数生长期末期。斜面活化培养基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物P/。， p朋.5，琼脂2%，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。液体活化培养基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物1%， pH6.5，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。发酵培养基葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L ，酵母膏12g/L，MgS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备辅酶Ｑ↓［１０］的方法，是将粟酒裂殖酵母菌接入含有茄尼醇的培养基中，在温度为２５－３５℃、压力为５－２０ＭＰａ的超临界ＣＯ↓［２］的环境中进行发酵，得到辅酶Ｑ↓［１０］。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘萍，孙君社，肖霄，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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