本发明专利技术涉及预测血栓形成性疾病风险的试剂盒、方法和用途。同时采用ＰＣＲ方法检测凝血酶原基因多态性和凝血因子Ｖ Ｒ５０６Ｑ基因多态性的特异性引物、探针，特异性引物和探针在制备通过ＰＣＲ扩增生物核酸样品检测凝血酶原基因Ｇ２０２１０Ａ多态性和凝血因子Ｖ Ｒ５０６Ｑ基因多态性的试剂中的用途、检测凝血酶原基因Ｇ２０２１０Ａ多态性和凝血因子Ｖ Ｒ５０６Ｑ基因多态性的试剂盒及试剂盒的用途。属于医药领域。
Kit, method and use for predicting the risk of thrombosis disease
The present invention relates to kits, methods and uses for predicting the risk of thrombotic diseases. At the same time PCR method was used to detect specific primers, prothrombin gene polymorphism and coagulation factor V gene R506Q polymorphism probe uses specific primers and probe in the preparation by PCR amplification, nucleic acid detection kit uses biological samples of prothrombin gene G20210A polymorphism and coagulation factor V gene R506Q polymorphism in the detection kit and reagent a box of prothrombin gene G20210A polymorphism and coagulation factor V R506Q gene polymorphism. It belongs to the field of medicine.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种预测血栓形成性疾病发生风险的检测试剂盒、方 法和用途。更具体的，本专利技术涉及通过聚合酶链式反应方法，提供一种分析编码凝血酶 原基因和凝血因子V的多态性位点的试剂盒、方法和用途。
技术介绍
先天性血栓性疾病也称遗传性血栓形成倾向，是由于凝血，抗凝和纤溶系统某个环 节的特异性障碍而引起的一类疾病，以复发性静脉血栓为主要临床表现，大多属先天遗 传性，常首发于青少年时期。据西欧部分地区统计，发病率在20 / 100000以上，超出先 天性出血性疾病。继发于一些疾病的高凝状态和血栓形成与原发于凝血、抗凝血机理缺陷的先天性血 栓性疾病不同，常表现为止血，抗血栓机理非特异性，多环节的变化，病因多数是复合 性的。生理或一些体外的因素也可导致高凝状态，如高龄、妊娠、产后、剧烈运动、.情 绪激动、寒冷、吸烟、高脂饮食、药物(口服避孕药)等。不少内科疾病引起的高凝状 态和血栓形成包括①肿瘤；②自身免 疫性疾病系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎，Behcet 综合征；③内分泌及代谢性疾病糖尿病、肾上腺皮质功能亢进；④肾脏疾病肾病综 合征；⑤肝脏疾病；⑥心、脑血管疾病心绞痛、心肌梗塞、脑血栓、脑栓塞、短暂性 脑缺血、闭塞性脉管炎，原发性高血压；⑦血液病弥散性血管内凝血、血栓性血小板 减少性紫癜、夜间阵发性血红蛋白尿、骨髓增生综合征；⑧肺部疾病肺栓塞、慢性阻 塞性肺炎、成人呼吸困难综合征；⑨高粘血症白血病、红细胞增多症镰形红细胞病、 高免疫球蛋白血症；⑩高脂血症。静脉血栓形成(venous thrombosis ,VT)在发达国家年发病率1 %。，且随年龄增长呈递 增现象。儿童的发病率1/10万，老年人接近l % 。静脉血栓形成多发生在下肢深静脉, 与其相关的主要并发症是血栓后遗综合征及致死性的肺动脉栓塞，发生率分别是20 % 及1% 2% 。我国尚缺乏大规模血栓流行病学的调查资料。从近些年我科收治的病人 来看，静脉血栓形成是常见病、多发病。研究证明，凝血因子的基因多态性与血栓形成 密切相关。静脉血栓是一种多因子疾病，既有遗传因素，又有后天获得的一些危险因素。 因子V和因子II (凝血酶原)是两种最常见的影响家族性血栓形成倾向的因子，家族性 血栓形成倾向是一种威胁健康甚至造成死亡的疾病。用常规临床检测方法通常很难发现静脉血栓，但是，对于有家族史以及有其他严重疾病的患者，通过遗传预置筛查检测有 关致病因子，可能是预防这类疾病的一种合适途径。凝血酶原基因(F2)定位于人类第11号染色体(11pl-ql2)短臂上，其编码的蛋白 在应对伤害的凝血过程中发挥着重要的作用。F2编码的蛋白凝血酶原在凝血因子X和凝 血因子V、磷酸酯以及钙离子的激活作用下转化成凝血酶并且帮助引发凝血链级反应。凝血酶原基因最常见的突变发生在3'未翻译端区域，具体的位置是碱基对20210的碱 基G — A的置换。这一突变增加了 F2mRNA转录翻译的效率，其结果就是凝血酶原 转录数量的增加，而这将有利于功能性凝血酶原蛋白的翻译表达，最终会导致高凝状态。 凝血酶原(20210G—A)的突变不论是杂合子和纯合子均表现为半显性，会导致静脉栓 塞的发生以及复发的风险的增加。由凝血酶原(20210G—A)杂合突变在没有其他先天 遗传易感因素或者后天的环境易感因素的条件下导致的静脉栓塞的相对危险度是非突变 体的2-4倍。凝血因子V (F V)是一单链糖蛋白，分子量为330kD ，主要在肝脏合成。F V基 因定位于染色体lq23，长约80kb ，有25个外显子，其cDNA长6672bp，编码含2224 个氨基酸的蛋A质。研究表明，F V基因第IO号外显子第1691位上的G—A可引起高 凝状态。此点突变使F V蛋白分子第506位的精氨酸变成了谷氨酰胺(Arg —Gin), 这种突变的蛋白分子称为FV Q506或FV Leiden突变，该突变影响了蛋A C系统的抗 凝功能。上面提到506位Arg是APC灭活FV的第一个切割位点。Arg506 —Gin导致 APC灭活FV延长，这一结果使得FV对外源性APC产生抵抗而使APTT不能延长。 同时，突变的FV仍保持促凝活性，以及它灭活的延长使得凝血酶形成速度加快，凝血酶 的增加又反馈性激活FV、 F M使得凝血与抗凝血平衡失调导致高凝状态形成。FV Leiden突变，使得凝血酶形成增加，抑制了纤溶过程，这表明FV Leiden突变的 患者不仅比正常人易形成血栓，且形成后血栓不易被溶解。FV Leiden突变在欧洲人口 中比例2 7%。 VT病人中占20 50 %。 FVLeiden突变杂合子发生血栓的相对危险性 是正常人的7倍，而纯合子高达80倍。最常见的基因多态性为单核苷酸基因多态性(SNP)，即同一物种不同个体间染色体 上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多 态性。传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片 段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。本专利技术的目的是提供一种稳定可靠的高通量的预测血栓性疾病发病风险的试剂盒、 方法和用途。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案 一种检测试剂盒.包含检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的基因特异性引物和 探针，和检测凝血因子V基因第506位的R506Q多态性位点的基因特异性引物和探针。其中，检测凝血酶原基因多态性位点的正向引物为5，- CCGCTGGTATCAAATGGG -3 ，；反向引物为5' - CCAGTAGTATTACTGGCTCTTCCTG -3 ，。 检测凝血酶原基因 G20210A多态性位点的野生型探针为VIC - CTCAGCGAGCCTCAATG -MGB;突变型探针 为FAM-CTCAGCAAGCCTCAATG-MGB。检测凝血因子V基因多态性位点的正向引物 为 5，- TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA -3，； 反向引物为 5，-CTTGAAGGAAATGCCCCATTA -3，。 检测凝血因子V基因第506位的R506Q多态性位点 的野生型探针为VIC - GGCGAGGAATACAGGTAT -MGB;突变型探针为FAM -GGCGAGAAATACAGGTAT陽MGB。本专利技术提供的试剂盒，还可以含有PCR反应混合液和Taq DNA聚合酶等PCR应用 试剂。其中，PCR反应混合液含有100 mM Tris-HCl、 100 mM KC1、 5.0uM MgCl2、 0.4mM dATP、 0.4mMdCTP、 0.4mMdGTP、 0.4mMdTTP; Taq DNA聚合酶的含量为1-10 U/ul' 优选5U/ul。本专利技术提供的试剂盒，还可以含有凝血酶原基因G20210A多态性位点野生型和突 变型的阳性对照，和凝血因子V基因第506位的R506Q多态性位点野生型和突变型的阳 性对照。阳性对照选自基因组DNA、 RNA或者克隆到载体上的DNA片段，其中载体为质粒 载体。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种预测血栓形成性疾病发生风险的试剂盒，其特征在于，包含检测凝血酶原基因Ｇ２０２１０Ａ多态性位点的特异性引物、探针和检测凝血酶原基因Ｇ２０２１０Ａ多态性位点的特异性引物、探针；以及包含检测凝血因子Ｖ Ｒ５０６Ｑ基因多态性的特异性引物、探针和检测凝血因子Ｖ Ｒ５０６Ｑ多态性位点的特异性引物、探针。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张彦明，王燕，于多，徐希平，
申请(专利权)人：北京华安佛医药研究中心有限公司，深圳奥萨医药有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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