本发明专利技术涉及生物基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种小立碗藓抗低温胁迫基因Ｐｐ ＮＰＬ４ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎｌ及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和转基因细胞系。所述基因的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３所示。本发明专利技术获得的基因具有高效的抗逆性。通过常用的基因工程技术，可以利用该基因培育出优质的转基因农作物，从而提高农作物的抗逆性。
Low temperature resistant gene PpNPL4, family, protein1 and its protein and vector of small bowl moss
The present invention relates to gene engineering field, in particular, the invention relates to a physcomitrellapatens Pp NPL4 family proteinl low temperature stress gene and its encoding protein, a vector containing the gene and transgenic cell lines. The nucleotide sequences of the genes, such as SEQ, ID, No.1, show the amino acid sequences of their encoded proteins, such as SEQ, ID, and No.3. The gene obtained by the invention has high resistance to stress. Through the use of genetic engineering technology, the gene can be used to produce high-quality transgenic crops, thereby enhancing the resistance of crops.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种小立碗藓抗低温胁 迫基因基因尸p APi^ /a肌7y/7/v^ei7及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、 和转基因细胞系。
技术介绍
低温、干旱、高盐是限制植物生长发育、地理分布、形态建成等的重要环境 胁迫因素。这些胁迫因素作用的结果均导致植物细胞失水，影响植物细胞的渗透 压，进而影响植物正常的生理代谢，严重时导致植物的死亡。通过对一些模式植 物的研究发现这三种胁迫因素诱导表达的功能蛋白及转录因子相互交差，因此， 寻求同时具有忍耐低温、千旱、高盐胁迫的绿色植物来研究植物的非生物胁迫极 有必要。对苔藓植物的基础研究标明苔藓植物是极地低温度环境的先锋植物之一， 同时它也分布在极端干旱的沙漠。在漫长的生物进化历程中，苔藓植物形成了一 套独特的适应低温干燥等恶劣环境的机制。对小立碗藓非生物胁迫研究发现 (Frank等，2005)，与其他高等植物相比，小立碗藓(尸/ j^co肌'trea/ ate/ s) 可以忍耐极端的生态环境。如，拟南芥在100mM的NaCl处理下即受到伤害(Sunkar 等，2003)，而小立碗藓可以忍耐350mM的NaCl溶液，在缓慢的逐渐提高的盐处 理条件下，小立碗藓可以忍耐600mM的NaCl胁迫。500mM的山梨醇处理三天后， 小立碗藓仍可以幸存。当小立碗藓失水92%时仍可恢复正常生长发育。在脱水、盐 渍和渗透胁迫条件下，Frank等(2003)分析鉴定了一系列上调基因，其编码的蛋白3主要有胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase)、甜菜碱(glycine betaine)、三氢 吡咯羧酸盐(deltall-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase)、促 分裂素原活化蛋白激酶(MAPkinase)等。在O'C低温胁迫七天后小立碗藓仍可恢复 生长 (Minami 等，2005 )， 且在冷驯化过程中激活了 LEA (late-embryogenesis-abundant)蛋白的转录，提高了其冰冻耐受能力。因此从苔藓植物中克隆抗逆相关基因并进一步通过转基因等技术应用于提高 农作物的抗逆性是目前研究的热点之一。
技术实现思路
为了解决上述问题提出并完成了本专利技术。本专利技术的目的是提供一种高效的抗低温胁迫相关基因。本专利技术的另一目的是提供上述基因编码的蛋白质。本专利技术的再一目的是提供含有上述基因的载体。本专利技术的再一目的是提供表达上述基因的转基因细胞系。具体地，本专利技术的专利技术人将培养至15叶左右的小立碗藓茎叶体在O'C下经过 不同时间的处理与非处理小立碗藓茎叶体组成差异材料，通过cDNA-AFLP技术得 到差异表达的EST，随后在分子水平进行表达分析或蛋白质水平的分析，挑选出了 一种具有显著抗逆特性的基因一小立碗藓抗逆基因户P APZ4 Z^/w'7/ /^ofej'/7入其 碱基序列如SEQ ID No. 1所示，其cDNA序列如SEQ ID No. 2所示。进一步，本专利技术还提供了上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3 所示。在本专利技术的完成过程中，还提供了包含上述基因的载体、以及表达该基因的 转基因细胞系。本专利技术获得的基因具有高效的抗逆性。通过常用的基因工程技术，可以利用 该基因培育出优质的转基因农作物，从而提高农作物的抗逆性。图1为尸p AW^ /a肌7y prei/77基因的cDNA-AFLP图谱，其中，Maker:分 子量标记；1、未驯化的24小时的材料；2、未驯化的12小时的材料；3、冷驯化 的24小时的材料；4、冷驯化的12小时的材料。图2为尸p/kw7y prei/ /基因的Real-time RT-PCR相对表达量变化图。具体实施例方式1、小立碗藓的培养及冷胁迫处理 将小立碗藓培养至15叶左右，移入0。C处理0、 3、 6、 12、 24、 48、 72小时，分别取材用于cDNA-AFLP分析。附小立碗藓培养基配方及制备附图说明大量元素 Ca(N03)2 4H200. 8 g /L 0.0125 g/L 0.25 g/LFeS04 7H20 MgS04 7H20微量元素 CuS04 5H20 ZnS04 7H20 H3B030.055 mg/L 0.055 mg/L 0.614 mg/L 0.389 mg/L 0.055 mg/L 0. 028 mg/L 0. 025 mg/LMnCl2 4H20 CoCl2 6H20Na2Mo04 2H20 Glucose5g/ L 0. 5g/ L lml/ L酒石酸铵 磷酸盐缓冲液5微量元素配制成1000X母液，4'C存放。 固体基本培养基，加入浓度为0. 8%琼脂粉。磷酸缓冲液的配制取25g KH2P04溶解于100 ml蒸馏水，用4 M KOH调整pH7. 0， 4'C存放。2、 cDNA-AFLP分析 cDNA-AFLP方法参照Christian, 1998。1) 小立碗藓RNA提取(TE3D法)和DNase I处理2) mRNA的分离mRNA从总RNA中分离，按照Promega公司试剂盒PolyA Tract mRNA Isolation system介绍的方法进行。3) cDNA的合成cDNA按照TaKaRa公司试剂盒cDNA Synthesis Kit(M-MLV Version)介绍的 方法进行。4) 双酶切采用EcoRI和Msel两种限制性内切酶对cDNA进行双酶切。模板cDNA (200ng/ u 1) 1. 25 u 1缓冲液(10X) 2p1EcoRI 5U/u1 1 y 1Msel 5U/ul lulddH20 14.75ul总体积 20 nl混匀离心，37°C酶切至少3个小时，最好过夜直至cDNA被完全酶切； 酶切完全后，反应混合物置65'C加热15min，使限制性内切酶失火，之后将 反应管置冰上冷却；1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,呈现均匀弥散为较好酶切效果。5)接头连接采用EcoRI adaptor和Msel adaptor两种接头连接，所用接头见表2. 1。酶切反应液20 n 1缓冲液(iox)2y 1T4-连接酶(10U/u 1)0. In 1ATP(10raM)0. 2u 1EcoRI接头 50praol/ullu 1Msel接头 50pmol/yllu 1ddH205. 7n 1总体积30 n 1混合离心，37。C至少连接3小时，-2(TC可长期保存。6)预扩增以E0和M0为引物做预扩增，所用引物见表2.1。加入以下试剂于反应管中:模板DNA(连接反应液)2. 0u 1缓冲液(iox)2.0ii 1MgC12(25mM)1.2u 1EcoRI引物(E0， 50ng/u 1 )0.6u 1Msel引物(MO， 50ng/u 1)0.6u 1Taq酶(5U/u 1)0.2n 1dNTP(10mM)0.2u 1H2013. 2ix 1总体积20 u 1PCR反应程序94°C、 3min; 94°C、 30s， 56本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小立碗藓抗低温胁迫基因Ｐｐ ＮＰＬ４ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ１，其特征在于，其碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示。
【技术特征摘要】
1、一种小立碗藓抗低温胁迫基因Pp NPL4 family protein1，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。2、 一种小立碗藓抗低温胁迫基因尸p 7W^4 /a/w7y protei/ 7，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：何奕昆，王慧，胡勇，崔素霞，孙铭明，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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