本发明专利技术公开了一种与植物抗低温相关的miRNA，其具有序列表中SEQ?ID?NO：1所示的序列；在大豆中过表达SEQ?ID?NO：1所示的miRNA，或抑制SEQ?ID?NO：1所示miRNA的表达，以培育出具有高抗低温性的转基因大豆，对提高大豆产量具有重大的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种与植物抗低温相关的miRNA，尤其是一种来源于大豆的、能够调节大豆抗低温性的miRNA ；本专利技术还涉及此miRNA的前体及用途。
技术介绍
大豆是非常重要的、具有特殊经济价值的作物。低温等环境胁迫对大豆的生长发育具有重要影响，严重时会造成大豆大规模减产。解析大豆抵抗低温的分子机制，培育耐低温的大豆品种是目前大豆种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程育种已经成为增强作物耐低温性的重要手段。高等植物在应答低温胁迫时启动了多种应答网络，研究表明， microRNA (miRNA)在其中也具有非常重要的作用。miRNA是近年来研究发现的一种长20 24 nt的内源性非蛋白编码RNA。miRNA 基因最初转录产生具有颈环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，引起mRNA 降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用(Llave et al. , 2002; Palatnik et al. , 2003; Tang et al. , 2003)。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种与植物抗低温相关的miRNA及其前体序列， 利用此miRNA能够提高大豆的抗低温性，对提高大豆产量具有重大的意义。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。一种与植物抗低温相关的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO 1所示的序列。上述与植物抗低温相关的miRNA的前体序列，其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。上述与植物抗低温相关的miRNA在培育抗低温转基因植物中的应用。作为上述应用的一种优选技术方案，所述抗低温转基因植物为大豆。作为上述应用的一种优选技术方案，在大豆中过表达SEQ ID NO :1所示的miRNA， 或抑制SEQ ID NO 1所示miRNA的表达，培育出具有高抗低温性的转基因大豆。采用上述技术方案所产生的有益效果在于本专利技术miRNA的表达受到低温胁迫的调节，说明其在大豆适应低温胁迫机制中起重要作用，基于此，可利用其培育具有高抗低温性的转基因大豆，对提高大豆产量具有重大的意义。附图说明图1为gma-miR169C前体序列的茎环结构图，可见其前体序列折叠成一种稳定的茎环结构，属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征。图2为低温胁迫条件下gma-miR169C在根及根瘤中的表达特征的定量PCR结果。图3为用大豆毛状根转化体系检测到的gma-miR169C在大豆根中对低温胁迫的响应。具体实施例方式以下实施例详细说明了本专利技术。本专利技术所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验， 结果取平均值。实施例1、实时荧光定量PCR分析gma-miR169C在低温胁迫下的表达特性一、胁迫处理胁迫根瘤材料按照以下流程进行WilimaS82大豆种子用70%的洒精灭菌30 S，dH20 冲洗6遍后播种于无菌培养皿中，皿底置2张无菌滤纸，dH20浸湿，28 °C暗萌发3天。芽长至2 cm时，移至放有湿润滤纸的试管中，芽长至4 5 cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接种30 min，低N水培，10，000 lux，温度为26 °C，相对湿度为70%，培养28天，胁迫处理，取根瘤。低温处理4°C处理24小时后取根瘤，于液氮速冻，-80°C保存备用。二、miRNA 的分离取根瘤，用microRNA提取试剂盒(百泰克公司)(Cat # RP5301)提取小片段RNA，提取方法如下(1)勻浆处理根瘤用液氮内研钵快速磨碎，每50 100 mg组织加1 ml裂解液后勻浆。(2)将勻浆样品剧烈震荡混勻，在15 -30 °C条件下孵育5 min以使核蛋白体完全分解。(3)4 ！的条件下12，000 rpm离心10 min，小心取上清转入一个新的RNase free的离心管中。当样品富含蛋白质、脂肪、多糖时，可离心10 min，移除勻浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜、多糖、以及高分子量DNA，而上层的超浮游物含有RNA。(4)每1 ml裂解液加0. 2 ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15 s并将其在室温下孵育3min。(5)样品于4 V 12，000 rpm离心10 min，会分成三层下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加裂解液体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。(6)加入0. 6倍体积70%乙醇，颠倒混勻(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中。(7)10, 000 rpm离心45 s，收集下滤液(下滤液中含有microRNA)，准确估计下滤液的体积(准确性非常重要)，加入2/3倍体积的无水乙醇，颠倒几次混勻，将混合液倒入到吸附柱RB中，10，000 rpm离心30 s弃掉废液。(8)加入700 μ 1漂洗液RW，12，000 rpm离心60 s，弃掉废液。(9)加入500 μ 1漂洗液RW，12，000 rpm离心60 s，弃掉废液。(10)将吸附柱RB放回空收集管中，12，000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。(11)取出吸附柱RB，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜中间部位加60-80 μ 1 RNase free water(事先在65-70 °C水浴中加热)，室温放置2 min， 然后12，000 rpm离心1 min。收集得到纯净microRNA保存于-80 °C冰箱。三、反转录为cDNA用天根miRNA cDNA第一链合成试剂盒将纯化的miRNA反转录为cDNA。1.小 RNA 的 Poly (A)加尾反应液的配置小 RNA6 μ 1E-PAP (5U/y 1)0. 4 μ 110ΧΡΑΡ Buffer2 μ 15 XrATP solution4 μ 1Nuclease-free Water7. 6 μ 1总体积20 μ 1轻轻混勻上述配制的反应液，短暂离心后，37°C反应60min。所得反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20°C短暂保存，如需长期保存建议存放于-80°C。2. Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应反应液的配置Poly(A)反应液2μ110XRT primer2μ 110XRT Buffer2μ 1超纯 dNTP Mixture (2. 5Mm)1 μ 1Rnasin (40U/μ 1)1 μ 1Quant RTase0. 5 μ 1RNase-free ddH201. 5μ 1总体积20 μ 1轻轻混勻上述配制的反应液，短暂离心后，37°C反应60min。合成的cDNA反应液放置-20°C保存，也可以直接进行下游荧光定量检测。四、实时荧光定量PCR按如下反应体系，混好体系，然后分装入96孔光学板中，并覆盖上专用光学膜。扩增使用的仪器为ABI公司的荧光定量PCR仪。扩增程序为95"C 30s ；95 "C 5 s，60 "C 34s,45 cycles ；95 "C 15 s，60 "本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种与植物抗低温相关的ｍｉＲＮＡ，其特征在于：其具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，王幼宁，陈亮，石磊，李东晓，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：13
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