一种铁皮石斛人工种子的制作方法技术

本发明专利技术提供了一种应用人工种子繁育铁皮石斛的实用技术。本发明专利技术的目的在于提供一种高效率、低成本繁育铁皮石斛的技术。所述技术为将铁皮石斛种子在萌发培养基上诱导并获得原球茎，随后进行原球茎的增殖培养，再转入含有０．５ｍｇ／ＬＡＢＡ的ＭＳ培养液内振摇培养（１００ｒ／ｍｉｎ），每１０ｄ更换培养液１次。３０ｄ后用６目尼龙网筛选择长×宽约为０．５－１．５ｍｍ×２．０－３．４ｍｍ原球茎作为包埋繁殖体，采用滴注法进行人工种子制作，以ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．３％ＡＣ＋３％海藻酸钠＋０．３％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加１．５－２．０％的淀粉、１．０－２．０％的保水剂和１．０－３．０％的纳米ＴｉＯ２，以海藻酸钠添加２％壳聚糖和５．０－１０％纳米ＴｉＯ２为人工种皮基质，并进行人工种子的萌发和贮藏研究。

Method for making artificial seeds of Dendrobium officinale

The invention provides a practical technique for breeding Dendrobium candidum with artificial seeds. The aim of the invention is to provide a high-efficiency and low-cost technique for breeding Dendrobium officinale. The technology for Dendrobium seed on germination medium and induced protocorm, followed by protocorm proliferation, and then transferred to the 0.5mg / LABA containing MS medium in shaking culture (100r / min), the medium was changed 1 times per 10d. 30d with 6 mesh nylon net selective length * width is about 0.5 1.5mm * 2 3.4mm as embedded protocorm propagation, artificial seed production by drip method, with MS + 0.5mg / LBA + 0.5mg / LNAA + 0.3%AC + 3% sodium alginate + 0.3% chlorothalonil as artificial endosperm, nano TiO2 add 1.5 - 2% on the basis of the starch, water retaining agent 1 - 2% and 1 - 3%, adding 2% sodium alginate chitosan and 5 - 10% nm TiO2 artificial seed coat matrix, germination and storage of artificial seeds and.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物工程
具体涉及一种应用人工种子繁育铁皮石斛的实用技 术。
技术介绍
铁皮石斛Dendrobium candidum Wall, ex Lindl.为兰科石斛属植物，是我国传统 名贵中药，居“中华九大仙草”之首，具有滋阴清热、生津止渴的功效。现代药理研究表明， 还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用，因此在临床及 中药复方中被广泛应用。铁皮石斛是一种生长缓慢、自身繁殖能力极低的兰科附生植物，由 于其具有巨大的药用价值和保健价值，导致被长期掠夺性采挖，致使野生资源严重枯竭。为了更好地保护铁皮石斛野生资源，保障资源的可持续利用，将铁皮石斛野生变 家种，发展规模化人工栽培，是保障铁皮石斛资源可持续利用的重要举措。人工种植铁皮石 斛首先面临的就是种苗的来源问题。铁皮石斛种子极小、无胚乳，自然条件下需与某些真菌 共生才能萌发，很难用实生苗栽培；而传统的分株、扦插等繁殖方式不仅繁殖率极低，而且 长期无性繁殖，病原体逐代积累并传递，导致种质退化，品质变劣，产量降低，严重威胁其药 材的生产。近年来国内外的研究者对铁皮石斛快繁方面积累了大量的工作经验，利用组织 培养虽能在一定程度上解决快繁问题，但其试管苗生产周期长，成本高，还一直存在着移栽 驯化过程长，脱瓶移栽存活率低等问题，且不便贮藏和运输，难以进行大规模栽培，远远不 能适应国内外市场的需求，从而限制了铁皮石斛的规模化和产业化生产。人工种子技术的 诞生为珍稀紧缺的铁皮石斛药材产业化提供了一条新的途径，它使得无菌生长的原球茎可 以直接播入土壤，与试管苗相比，减少了移栽驯化过程，并且生产周期短，从而大大降低试 管苗培育和移栽驯化中的风险。前人在人工胚乳、包埋方法、人工种皮、贮藏方法等方面做 了很多探索，但是还存在如何提高人工种子的萌发率和成苗率、如何进行人工种子贮藏等 问题。包埋剂的选择及制作工艺方面尚需改进，以提高原球茎到正常植株的转化率，并达到 加工运输方便、防干防腐耐贮藏的目的。在人工胚乳或人工种皮中添加特殊材料来促进其 萌发或延长人工种子的贮藏问题已成为人们研究的重点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效率、低成本繁育铁皮石斛的技术。我们将铁皮石斛种子在萌发培养基上诱导并获得原球茎，随后进行原球茎的增殖 培养，再转入含有o. 5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(lOOr/min)，每10d更换培养液1 次。30d后用6目尼龙网筛选择长X宽约为0. 5-1. 5mmX 2. 0-3. 4mm原球茎作为包埋繁殖 体，采用滴注法进行人工种子制作，以MS+0. 5mg/LBA+0. 5mg/LNAA+0. 3% AC+3%海藻酸钠 +0. 3%百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加1. 5-2. 0%的淀粉、1. 0-2. 0%的保水剂和 1. 0-3. 0%的纳米Ti02，以海藻酸钠添加2%壳聚糖和5. 0-10%纳米Ti02为人工种皮基质， 并进行人工种子的萌发和贮藏研究。本专利技术的铁皮石斛人工种子制作方法，其特征包括以下的步骤(1)种子无菌萌发选取铁皮石斛成熟未开裂蒴果，自来水冲洗表面污渍5min，在超净工作台中， 用70%酒精棉球擦拭果壳表面沟纹，然后将整个蒴果放入在0. 升汞溶液中灭菌 15-25min，无菌水冲洗4_5次，吸干表面水分。在超净工作台上，用消过毒的手术刀将果实 切开，用接种针将粉末状胚接种到种子萌发培养基表面，接种两周后，种子萌发形成原球 茎，从而建立原球茎诱导体系。(2)原球茎增殖将种子萌发的原球茎接种于增殖培养基中进行培养，接种量，以鲜重计，每瓶3g， 原球茎增殖培养基为MS+1. 0mg/LKT+0. 2mg/LNAA,每升培养基添加50_100ml椰子汁和 10-20g 纳米 Ti02。上述步骤(1)-⑵中培养基pH值为5. 4-5. 6，培养温度(25士2) °C，光照强度 20001x/10h。(3)铁皮石斛人工种子制作将增殖后的原球茎，转入含有0. 5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(lOOr/min)，每 10d更换培养液1次。30d后用6目尼龙网筛选择长X宽约为(0. 5-l.5mmX2.0-3.4mm) 原球茎作为包埋繁殖体。以MS+0. 5mg/LBA+0. 5mg/LNAA+0. 3% AC+3%海藻酸钠+0. 3%百菌 清为基本人工胚乳，在此基础上添加1. 5-2. 0%的淀粉、1. 0-2. 0%的保水剂和1. 0-3.0% 的纳米Ti02，以海藻酸钠为人工种皮基质(用CaCl2固化)。用蒸馏水配制2%的CaCl2， 经高压灭菌，冷却备用。采用滴注法，在超净台上，将原球茎浸入含有海藻酸钠的人工胚乳 中，5min后用吸管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴到添加2%壳聚糖和5. 0-10%纳 米Ti02的2% CaCl2溶液中，确保每颗人工种子只包裹一个原球茎。在CaCl2溶液中经过 15min的离子交换，自动固化成粒，取出用蒸馏水冲洗干净，置于滤纸上吸去表面水分，获得 铁皮石斛人工种子。(4)人工种子萌发在不同的萌发基质上进行萌发试验，萌发基质分别为纯琼脂培养基、MS培养基、 复合基质(无菌)、复合基质(有菌)，复合基质为砂土 锯末=1 3 (基质先经KMn04和 甲醛熏蒸消毒，密封5天后敞开散尽甲醛蒸汽)。相同条件下制作的人工种子在不同萌发基 质中的萌发率和成苗率也有较明显的差异，在MS琼脂培养基的萌发基质上，人工种子的萌 发率、成苗率最高，其次是纯琼脂培养基，然后是复合基质(无菌萌发)，复合基质(有菌萌 发)。在人工种子制作中添加纳米材料可阻止营养成分的外泄，并能增强铁皮石斛人工种子 抗菌能力，从而提高人工种子在有菌条件下的萌发率。(5)人工种子贮藏将制作好的人工种子放入灭菌并烘干的三角瓶中，用封口膜封好，在4°C下分别贮 藏 30d 和 60d。虽然国内有关于铁皮石斛人工种子制作的报道，但是制作出的人工种子仅在培养 基中萌发成功，未实现在复合基质或有菌基质中的萌发。本专利技术利用纳米Ti02制作的复合 人工胚乳和人工种皮，不仅可以改善海藻酸钠包埋系统的透气性、保水性和吸水性，缩短人 工种子萌发时间，而且可以抑制微生物的繁殖和生长，达到抑菌、防腐的作用，并能促进人工种子胶粒中的原球茎生长，从而提高人工种子的在复合基质中的萌发率和成苗率，为铁 皮石斛人工种子实用化提供技术支持，从而为铁皮石斛的繁育开辟了一条新的途径。具体实施例方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，不是对本专利技术的限制。实施例1 选取广东永生源生物科技有限公司引种自云南省文山县生长健壮的铁皮石斛，开 花时进行人工授粉，将授粉后100天的成熟未开裂果实作为外植体。用自来水冲洗表面 污渍5min，在超净工作台中，用70 %酒精棉球擦拭果壳表面沟纹，然后将整个蒴果放入在 0. 升汞溶液中灭菌15min，无菌水冲洗4-5次，吸干表面水分。在超净工作台上，用消过 毒的手术刀将果实切开，用接种针将粉末状胚接种到种子萌发培养基(以MS培养基为基本 培养基，每升含椰子汁50ml，活性炭10g，蛋白胨lg，蔗糖20g，琼脂9g，pH值为5. 4)表面， 接种两周后，种子萌发形成原球茎，从而建立原球茎诱导体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铁皮石斛人工种子制作方法，其特征在于具体步骤如下：（１）种子无菌萌发选取铁皮石斛成熟未开裂蒴果，自来水冲洗表面污渍５ｍｉｎ，在超净工作台中，用７０％酒精棉球擦拭果壳表面沟纹，然后将整个蒴果放入在０．１％升汞溶液中灭菌１５－２５ｍｉｎ，无菌水冲洗４－５次，吸干表面水分。在超净工作台上，将果实用消毒后手术刀切开，用接种针将粉末状胚接种到种子萌发培养基表面，接种两周后，种子萌发形成原球茎，从而建立原球茎诱导体系。（２）原球茎增殖将种子萌发的原球茎接种于增殖培养基中进行培养，接种量，以鲜重计，每瓶３ｇ，原球茎增殖培养基为ＭＳ＋１．０ｍｇ／ＬＫＴ＋０．２ｍｇ／ＬＮＡＡ，每升培养基添加５０－１００ｍｌ椰子汁和１０－２０ｇ纳米ＴｉＯ↓［２］。上述步骤（１）－（２）中培养基ｐＨ值为５．４－５．６，培养温度（２５±２）℃，光照强度２０００ｌｘ／１０ｈ。（３）铁皮石斛人工种子制作将增殖后的原球茎，转入含有０．５ｍｇ／ＬＡＢＡ的ＭＳ培养液内振摇培养（１００ｒ／ｍｉｎ），每１０ｄ更换培养液１次。３０ｄ后用６目尼龙网筛选择长×宽约为（０．５－１．５ｍｍ×２．０－３．４ｍｍ）原球茎作为包埋繁殖体。以ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．３％ＡＣ＋３％海藻酸钠＋０．３％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加１．５－２．０％的淀粉、１．０－２．０％的保水剂和１．０－３．０％的纳米ＴｉＯ↓［２］，以海藻酸钠为人工种皮基质（用ＣａＣｌ↓［２］固化）。用蒸馏水配制２％的ＣａＣｌ↓［２］，经高压灭菌，冷却备用。采用滴注法，在超净台上，将原球茎浸入含有海藻酸钠的人工胚乳中，５ｍｉｎ后用吸管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴到添加２％壳聚糖和１．０－３．０％纳米ＴｉＯ↓［２］的２％ＣａＣｌ↓［２］溶液中，确保每颗人工种子只包裹一个原球茎。在ＣａＣｌ↓［２］溶液中经过１５ｍｉｎ的离子交换，自动固化成粒，取出用蒸馏水冲洗干净，置于滤纸上吸去表面水分，获得铁皮石斛人工种子。（４）人工种子萌发在不同的萌发基质上进行萌发试验，萌发基质分别为：纯琼脂培养基、ＭＳ培养基、复合基质（无菌）、复合基质（有菌），复合基质为砂土∶锯末＝１∶３（基质先经ＫＭｎＯ↓［４］和甲醛熏蒸消毒，密封５天后敞开散尽甲醛蒸汽）。相同条件下制作的人工种子在不同萌发基质中的萌发率和成苗率也有较明显的差异，在ＭＳ琼脂培养基的萌发基质上，人工种子的萌发率、成苗率最高，其次是纯琼脂培养...

【技术特征摘要】
一种铁皮石斛人工种子制作方法，其特征在于具体步骤如下(1)种子无菌萌发选取铁皮石斛成熟未开裂蒴果，自来水冲洗表面污渍5min，在超净工作台中，用70％酒精棉球擦拭果壳表面沟纹，然后将整个蒴果放入在0.1％升汞溶液中灭菌15-25min，无菌水冲洗4-5次，吸干表面水分。在超净工作台上，将果实用消毒后手术刀切开，用接种针将粉末状胚接种到种子萌发培养基表面，接种两周后，种子萌发形成原球茎，从而建立原球茎诱导体系。(2)原球茎增殖将种子萌发的原球茎接种于增殖培养基中进行培养，接种量，以鲜重计，每瓶3g，原球茎增殖培养基为MS+1.0mg/LKT+0.2mg/LNAA，每升培养基添加50-100ml椰子汁和10-20g纳米TiO2。上述步骤(1)-(2)中培养基pH值为5.4-5.6，培养温度(25±2)℃，光照强度2000lx/10h。(3)铁皮石斛人工种子制作将增殖后的原球茎，转入含有0.5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(100r/min)，每10d更换培养液1次。30d后用6目尼龙网筛选择长×宽约为(0.5-1.5mm×2.0-3.4mm)原球茎作为包埋繁殖体。以MS+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.3％AC+3％海藻酸钠+0.3％百菌清为基本人工胚乳，在此基础上添加1.5-2.0％的淀粉、1.0-2.0％的保水剂和1.0-3.0％的纳米TiO2，以海藻酸钠为人工种皮基质(用CaCl2固化)。用蒸馏水配制2％的CaCl2，经高压灭菌，冷却备用。采用滴注法，在超净台上，将原球茎浸入含有海藻酸钠的人工胚乳中，5min后用吸管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴到添加2％壳聚糖和1.0-3.0％纳米TiO2的2％CaCl2溶液中，确保每颗人工种子只包裹一个原球茎。在CaCl2溶液中经过15min的离子交换，自动固化成粒，取出用蒸馏水冲洗干净，置于滤纸上吸去表面水分，获得铁皮石斛人工种子。(4)人工种子萌发在不同的萌发基质上进行萌发试验，萌发基质分别为纯琼脂培养基、MS培养基、复合基质(无菌)、复合基质(有菌)，复合基质为砂土∶锯末＝1∶3(基质先经KMnO4和甲醛熏蒸消毒，密封5天后敞开散尽甲醛蒸汽)。相同条件下制作的人工种子在不同萌发基质中的萌发率和成苗率也有较明显的差异，在MS琼脂培养基的萌发基质上，人工种子的萌发率、成苗率最高，其次是纯琼脂培养基，然后是复合基质(无菌萌发)，复合基质(有菌萌发)。在人工种子制作中添加纳米材料可阻止营养成分的外泄，并能增强铁皮石斛人工种子抗菌能力，从而提高人工种子在有菌条件下的萌发率。(5)人工种子贮藏将制作好的人工种子放入灭菌并烘干的三角瓶中，用封口膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏源，刘星华，
申请(专利权)人：刘宏源，刘星华，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]