肝脏X受体激动剂的筛选方法技术

本发明专利技术是涉及一种肝脏Ｘ受体（ＬＸＲ）激动剂（ａｇｏｎｉｓｔ）的筛选方法，尤其是涉及一种利用本发明专利技术构建的α－ＳＥＡＰ表达质粒所建立的筛选平台以供筛选可活化ＬＸＲ的激动剂的方法；同时利用此方法筛选得升麻生药与升麻科学中药的水及酒精萃取物为ＬＸＲ的激动剂。

Screening methods for hepatic X receptor agonists

The present invention relates to a kind of liver X receptor (LXR) agonist (agonist) screening method, especially relates to a SEAP constructed by the expression plasmid screening platform established for screening method of agonists could activate LXR; water and alcohol extract and use this method to screening cohosh pharmacognosy and scientific Chinese medicine for Cimicifuga LXR agonist.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肝脏X受体(Liver X receptor, LXR)激动剂(agonist)的筛选方法，以及利用此方法筛选得肝脏X受体的激动剂。
技术介绍
核受体(nuclear receptor ， NR )为具有诱发转录活性的超级家族 (superfamily )，肝脏X受体(Liver X receptor, LXR)属于核受体的成员之 一，其含量以肝脏与脂肪组织(adipose tissue)为最多，LXRs在人体内负责 调控胆固醇(cholesterol )、脂肪酸(fatty acid)和葡萄糖(glucose)的代谢与 平衡，且其为代谢脂质和脂蛋白质的重要调控因子。在哺乳动物中存在有两种 结构相近^f旦表达形式不同的LXRs:肝脏X受体alpha (liver X receptor alpha, LXR-a)以及肝脏X受体beta (liver X receptor beta, LXR-卩)(Willy, P, J Umesono, K.， Ong, E. S.， Evans, R. M., Heyman, R. A., and Mangelsdorf, D. J. 1995. LXR, a nuclear receptor that defines a distinct retinoid response pathway. Genes Dev. 9 (9) :1033-45.)，其中，LXR-a主要分部于肝脏和代谢旺盛的组 织如肾脏、小肠、脂肪组织和巨噬细胞等少数器官组织，而LXR-P则普遍存 在于各组织。典型的核受体作用方式是当专一性小分子配体(ligand)与核受体结合后， 改变核受体蛋白质结构，使其能与靶基因启动子的特定序列结合，从而促进该 基因表达，此传讯过程称为活化；而活化LXR以调控脂肪代谢过程为LXR受 体先与另 一种受体类维生素AX受体RXR ( retinoic X receptor, RXR)形成异 质双体(dimer)后，再通过前述胆固醇前驱物的活化，而进入细胞核内，并 结合至靶基因的启动子上具有特殊辨识序列的LXR反应区(LXR response element, LXRE),进而调控脂肪和胆固醇新陈代谢，降低血管中的胆固醇沉 淀；此外，LXR所活化的基因产物，已知在巨噬细胞及其他周边组织可以造 成月旦固醇的回流运输(reverse cholesterol transport )，而^f吏过量的胆固醇得以形成高密度脂蛋白(HDL) (Steffensen, K.R. and Gustafsson,丄A. 2004 .Putative metabolic effects of the liver X receptor (LXR). Diabetes. 53 Suppl 1 :S36-42.)， 高密度脂蛋白具有抗炎、抗氧化、抗血栓形成和NO诱导的多种特性，也可有 效降低心血管疾病及动脉粥状硬化的发生率。LXR激动剂(agonist)是一种可以和LXR结合，且启动LXR功能并增 加LXR讯息靶基因表达的物质，例如胆固醇前驱物(oxysterol)是活化LXR 的天然激动剂，其包含22-羟基胆固醇(22 (R)勿droxycholesterol )、 24-羟 基胆固醇(24 ( S ) -hydroxycholestero X 27-羟基胆固醇(27-hydroxycholesterol), 以及胆固醇酸(cholestenoic acid )等氧化态的胆固醇4汙生物；人工合成的 T0901317是强效的LXR激动剂，其化学全名为N-(2,2,2-三氟乙基)-N-[4 -[2,2，2_三氟-1-羟基三氟曱基)乙基]苯基]-苯磺酰胺 (N-(2,2，2-trifluoroethyl)-N-[4 - [2，2,2-trifluoro-l-hydroxy-l画(trifluoromethyl) ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide )。相关动物实验研究发现LXR的激动剂的使用除有助于治疗动脉硬化 (atherosclerosis)及心血管疾病夕卜(cardiovascular disease), 其也具有抗发炎 效果，且对于糖尿病(diabetes ) ( Proctor, G., Jiang, T., Iwahashi， M.， Wang, Z., Li, J. and Levi, M. 2006. Regulation of renal fatty acid and cholesterol metabolism, inflammation, and fibrosis in Akita and OVE26 mice with type 1 diabetes. Diabetes. 55( 9 ):2502-9.)和阿兹海默症(Alzheimer's disease ) ( Koldamova, R. P.， Lefterov, I. M.， Staufenbiel, M., Wolfe, D., Huang, S., Glorioso, J. C., Walter, M., Roth， M. G. and Lazo, J. S. 2005 .The liver X receptor ligand T0901317 decreases amyloid beta production in vitro and in a mouse model of Alzheimer's disease. J Biol Chem.ll, 280 ( 6 ) :4079-88.),甚至癌症治疗(Fukuchi, J.， Kokontis, J. M., Hiipakka, R.A., Chuu， C.R and Liao, S. 2004. Antiproliferative effect of liver X receptor agonists on LNCaP human prostate cancer cells. Cancer Res. Nov 1， 64 ( 21 ) :7686-9.)也 具有功效。因此，若能建立一种可筛选出活化LXR的激动剂的方法，将有助 于动脉粥状硬化、心血管疾病与阿兹海默症的治疗以及糖尿病的预防，并可应 用于抗发炎上。
技术实现思路
为可快速有效地找出能活化LXR的激动剂，本专利技术提供一种LXR激动剂 的筛选方法，并通过该筛选方法评估升麻(W/w'zcwM C/m/ci^^ e )中草药是否 可有效活化LXR的表达，以筛选出具有LXR活化功用的激动剂，进而达到预 防或治疗动脉粥状^^更化与心血管疾病等目的。筛选方法构建部份，是将可同时表达肝脏X受体alpha配体的结合区域 (LXR-a ligand binding domain, LXR-a LBD )与GAL-4脱氧核糖核酸结合 区(GAL-4 DNA binding domain, GAL-4 BD )的融合蛋白质(fosion protein )， 以及可受GAL-4上〉游启动序歹'J (GAL-4 upstream activation sequence, 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝脏Ｘ受体ａｌｐｈａ（ｌｉｖｅｒ　Ｘ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｌｐｈａ，ＬＸＲ－α）激动剂（ａｇｏｎｉｓｔ）的筛选方法，其步骤包含：　（ａ）构建一种表达质粒，该表达质粒至少包括肝脏Ｘ受体ａｌｐｈａ配体结合区域（ＬＸＲ－αｌｉｇａｎｄ　 ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ）的序列、ＧＡＬ－４脱氧核糖核酸结合区域（ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ）的序列、可受该ＧＡＬ－４脱氧核糖核酸结合区域辨识的ＧＡＬ－４上游启动序列（ＧＡＬ－４　ｕｐｓｔｒｅａｍ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）以及可受该ＧＡＬ－４上游启动序列调控的报告基因（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ）；　（ｂ）将该表达质粒转染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）至宿主细胞；　（ｃ）在该宿主细胞培养基中加入待测样品；　（ｄ）检测培养基中该报告基因的 表达量；　（ｅ）对比加入该待测样品时的该报告基因的表达量与未加入该待测样品时的该报告基因的表达量；以及　（ｆ）当步骤（ｅ）中该待测样品的该报告基因的表达量高于未加入该待测样品的该报告基因的表达量，则表示该待测样品含有可与肝脏Ｘ受 体ａｌｐｈａ配体结合区域相结合的配体（ｌｉｇａｎｄ），并判定该待测样品为可活化肝脏Ｘ受体ａｌｐｈａ的激动剂。...

【技术特征摘要】
1.一种肝脏X受体alpha(liver X receptor alpha，LXR-α)激动剂(agonist)的筛选方法，其步骤包含(a)构建一种表达质粒，该表达质粒至少包括肝脏X受体alpha配体结合区域(LXR-αligand binding domain)的序列、GAL-4脱氧核糖核酸结合区域(DNA binding domain)的序列、可受该GAL-4脱氧核糖核酸结合区域辨识的GAL-4上游启动序列(GAL-4 upstream activation sequence)以及可受该GAL-4上游启动序列调控的报告基因(reporter gene)；(b)将该表达质粒转染(transfect)至宿主细胞；(c)在该宿主细胞培养基中加入待测样品；(d)检测培养基中该报告基因的表达量；(e)对比加入该待测样品时的该报告基因的表达量与未加入该待测样品时的该报告基因的表达量；以及(f)当步骤(e)中该待测样品的该报告基因的表达量高于未加入该待测样品的该报告基因的表达量，则表示该待测样品含有可与肝脏X受体alpha配体结合区域相结合的配体(ligand)，并判定该待测样品为可活化肝脏X受体alpha的激动剂。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述报告基因的产物为能被侦测 及量化的酶或焚光蛋白。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述报告基因为分泌型碱性磷酸 酶(secreted alkaline phosphatase ， SEAP )。4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述报告基因的表达量通过酶标 仪(ELIS A reader)分析。5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。6. 根据权利要求5所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵 巢细胞(Chinese hamster ovary cell, CHO画kl )。7. —种升麻萃取物用以制备可活化肝脏X受体alpha (liver X receptor alpha LXR-a)的药物的用逸该升麻萃取物分离自升麻(i^/zowa生药或升麻科学中药。8. 根据权利要求7所述的用途，其中，所述升麻生药选自由三叶升麻(C7m//， /^rac/e*//a Kom.)、兴安升麻(CVm//， tfoW/ca ( Turcz.) Maxim.)以及升麻(CV附//wga/o幼Wa L.)所组成的组中。9. 根据权利要求7所述的用途，其中，所述升麻科学...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘胜勇，温武哲，郭茂田，
申请(专利权)人：国鼎生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]