蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法技术

本发明专利技术涉及的是一种生物技术领域的蛋白质－多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法。包括如下步骤：①把蛋白质加入多糖溶液，通过冷冻分离，使蛋白质被分配在多糖分散相中；②将溶液冷冻相分离，再将体系冷冻干燥，得干粉；③将有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到微粒；④将微粒分散在缓释注射的高分子；⑤将蛋白以外的试剂用同样的方法担载于多糖玻璃体微粒中；⑥通过将微粒分散在溶液中形成初乳，再分散在水相中形成复乳，或者通过微粒分散在溶液中形成初乳，再分散在另一油相中形成复乳，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。本发明专利技术对蛋白大分子药物的制剂方法适用于诸如多肽、ＤＮＡ、疫苗、抗体、或脂质体等其他结构脆弱的试剂。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法
本专利技术涉及的是一种生物
的制备方法。特别是一种蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法。
技术介绍
当结构脆弱的生物活性试剂，如蛋白质、多肽、核酸、病毒、疫苗、抗体、或脂质体等被包埋在生物相容性高分子材料中时，一般不可避免的接触有机溶剂(因为这些材料是脂溶性)，往往导致这些试剂变性失活。为了避免这种由于接触油水界面导致的变性失活，这些试剂通常在包埋前，制备成试剂-多糖或小糖的固体颗粒。为了达到缓释目的和避免严重的突释效应，蛋白-糖或多糖的颗粒通常要求小于10μm。蛋白质量或多肽预先包在水溶性的高分子粒子中，再包埋在可降解聚合物的装置也可以提高释放动力学曲线、减少不完全释放和突释。把蛋白质担载到好的多糖粒子中是一件非常坚决任务，由于报道颗粒的制备方法通常药用到有机溶剂、界面张力(如油水界面或水空气界面，亲水和疏水界面)、高剪切力、高温条件和其它因素严重影响蛋白质的活性。不过最近在此领域有些进步。现有技术中的专利[CHEN，Li；ZHU，Hua；JIN，Tuo THE PREPARATION METHODOF A STABLE POLYMER AQUEOUS PHASE-AQUEOUS PHASE EMULSION AND ITS USE，Publication Number International：WO/2002/000778 Application No.：PCT/CN2001/001033](稳定的高分子水相-水相乳液的制备及其应用公开号为，WO/2002/000778国际申请号PCT/CN2001/001033)，该技术揭示了一种新型的稳定的乳液(高分子水相-水相乳液)及其制备方法和在制药及生物技术中的应用。该乳液与常规乳液的根本区别在于其分散相和连续相均为水溶液。这一乳液的主要用途在于对于有机溶剂敏感的化学及生物药物的剂型制备。其中生物药物包括蛋白，多肽，DNA，及活病毒。与常规乳液相比，主要优点在于上述敏感的治疗试剂不会因为与有机溶剂的接触而变性失活。对于上述治疗试剂的制备，-->保存，运输和释放提供了独到的优化机制，不过这个体系有点缺陷。如需要相对高的两种亲水性的高分子(一种是多糖和聚乙二醇)还需要第三种水溶性的聚合物(带有负电荷骨架聚电解质)形成一个稳定的乳液，聚电解质有稳定分散相多糖的效果防止其融合，如果蛋白质的溶解度小，多糖和蛋白质的比例太高，以至担载蛋白质的能力太低，因为多糖必须足够高才能发生相分离)。另外有些蛋白质可能和聚电解质(形成稳定的乳液必须的)发生作用，以至形成离子性的聚集。因此，需要一个更好方法把蛋白质担载在多糖玻璃体中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法。使其在降温过程中发生相分离并使多糖成为分散相，然后冻干并除去连续相得到多糖玻璃体微粒过程中，不需使用有机相(或称油相)乳化，不需使用交联剂、固化剂、表面活性剂稳定，不存在水-油、水-气等强界面张力的界面。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术包括如下步骤：①把蛋白质加入多糖溶液，通过水相-水相冷冻分离使蛋白质被分配在多糖分散相中；②将载有蛋白分子的多糖和聚乙二醇溶液冷冻相分离，再将体系冷冻干燥，得干粉；③将所得的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到载有蛋白的多糖玻璃体微粒的直径在0.06微米-10微米；④将含有多糖玻璃体微粒分散在缓释注射的高分子；⑤将蛋白以外的试剂用同样的方法担载于多糖玻璃体微粒中；⑥通过将蛋白-多糖玻璃体微粒分散在油溶的高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成复乳即水/油/固体(S/O/W)的方法，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成复乳即油/油/固体(S/O/O)的方法，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。所述的蛋白-多糖玻璃体，其蛋白质0.01％-50％、多糖为0.01％-50％，保护剂0％-10％，聚乙二醇为20％-80％。-->所述的保护剂为缓冲物质、盐类和小分子糖类物质，其浓度为多糖的重量百分比的0-10％。所述的保护剂为Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，盐类为Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖类为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。所述的高分子，指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽键的聚氨基酸，其中包括：聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸及其组合；还包括硅像胶、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明质酸、明胶、胶原蛋白、聚乙交酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝胶包括：聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸温敏型水凝胶、糖敏型凝胶和酸敏型凝胶。所述的蛋白质为：促红细胞生成素(EPO)、重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、疫苗、干扰素(INF)、生长激素(GH)、胰岛素(Insulin)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板生长因子(PDGF)、内皮生长因子(ECGF)、神经生长因子(NGF)、骨衍生性生长因子(BDGF)、骨形成蛋白(BMP)、组织多肽抗原(TPA)、抗体(antibody)、凝血因子VIII(VIII)及IX遗传因子和用于治疗的蛋白质或多肽。所述的蛋白以外的试剂为：反义核苷酸(anti-RNA)、小分子RNA(RNAi)、基因(DNA)、抗体、疫苗、或脂质体。所述的微粒其特征为蛋白质0.01％-50％、多糖为0.01％-50％、保护剂0％-10％、高分子为20％-80％。所述的温敏型凝胶，载于多糖玻璃体微粒或多糖溶液中的蛋白被选择性地分配在多糖相中处于热力学上更稳定的状态。此外，热敏液-胶体系在升温相变(从液体到胶状)过程中发生脱水收缩引起的突释，而分配在多糖相中的蛋白则可以在相当程度上避免这类突释。制备热敏液-胶体系时，本专利技术的方法制备的多糖玻璃体或者未经乳化冻干的含有蛋白的多糖溶液可以被直接加入低温下处于液体状态的温敏型凝胶。-->所述的蛋白质所制备的多糖玻璃体或者未经乳化冻干的含有蛋白的多糖溶液中的蛋白可以是溶液状态或者纳米粒状态。多糖玻璃体的除了在制剂过程中保护蛋白外，通过本专利技术中的方法所制备的多糖玻璃体微粒还具有在体温及水合条件下长时间地保持蛋白活性，并且改善蛋白释放动力学的作用。冷冻相分离是将低浓度(低于8％)的多糖溶液和PEG溶液混合形成均一的溶液，然后冷冻(避免液氮、干冰等速冻条件下)。冷冻过程中多糖相与PEG相发生相分离，多糖相成为分散相，PEG相成为连续相，而蛋白通过倾向于多糖的分配而存在于分散相中。冷冻相分离的样品冷冻干燥，并用有机溶剂洗去PEG连续相同样得到0.06-10微米的蛋白-多糖玻璃体微粒，即蛋白-多糖玻璃体微粒。本专利技术提供了一种简便且有效的方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质－多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：①把蛋白质加入多糖溶液，通过水相－水相冷冻分离使蛋白质被分配在多糖分散相中；②将载有蛋白分子的多糖和聚乙二醇溶液冷冻相分离，再将体系冷冻干燥，得干粉；　 　③将所得的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到载有蛋白的多糖玻璃体微粒的直径在０．０６微米－１０微米；④将含有多糖玻璃体微粒分散在缓释注射的高分子；⑤将蛋白以外的试剂用同样的方法担载于多糖玻璃体微粒 中；⑥通过将蛋白－多糖玻璃体微粒分散在油溶的高分子溶液中形成初乳，再分散在水相中形成复乳，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳，再分散在另一油相中形成复乳，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。

【技术特征摘要】
1、一种蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：①把蛋白质加入多糖溶液，通过水相-水相冷冻分离使蛋白质被分配在多糖分散相中；②将载有蛋白分子的多糖和聚乙二醇溶液冷冻相分离，再将体系冷冻干燥，得干粉；③将所得的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到载有蛋白的多糖玻璃体微粒的直径在0.06微米-10微米；④将含有多糖玻璃体微粒分散在缓释注射的高分子；⑤将蛋白以外的试剂用同样的方法担载于多糖玻璃体微粒中；⑥通过将蛋白-多糖玻璃体微粒分散在油溶的高分子溶液中形成初乳，再分散在水相中形成复乳，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳，再分散在另一油相中形成复乳，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。2、根据权利要求1所述的蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征是，所述的蛋白-多糖玻璃体，其蛋白质0.01％-50％、多糖为0.01％-50％，保护剂0％-10％，聚乙二醇为20％-80％。3、根据权利要求1所述的蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征是，所述的保护剂为缓冲物质、盐类和小分子糖类物质，其浓度为多糖的重量百分比的0-10％。-->4、根据权利要求3所述的蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征是，所述的保护剂为Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，盐类为Zn(AC)2、Zn...

【专利技术属性】
技术研发人员：金拓，袁伟恩，吴飞，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]