H9型禽流感病毒的快速检测技术制造技术

本发明专利技术公开一种从禽病料中检测病毒的方法，以及这种方法的用途。本发明专利技术的方法是无菌采集被检死禽的肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝或心等组织，或者无菌采集被检活禽的血液、气管拭子、泄殖腔拭子或粪便，采用Ｔｒｉｚｏｌ方法或ＭｉｎｉＢＥＳＴ病毒ＲＮＡ提取试剂盒从所采样品中提取ＲＮＡ，以提取的ＲＮＡ为模板，以外侧上、下游引物和内侧上、下游引物进行ＲＴ－ＬＡＭＰ反应，ＲＴ－ＬＡＭＰ反应结束后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测，以是否出现ＲＴ－ＬＡＭＰ反应特异的梯状条带来判断被检禽是否感染Ｈ９型禽流感病毒。

Rapid detection of avian influenza virus type H9

The invention discloses a method for detecting virus from poultry feed, and use this method. The method of the invention is aseptic collection detected dead poultry intestinal contents, lung, intestine, spleen, liver, bladder and heart tissue, or sterile acquisition seized live poultry blood and tracheal swabs, cloacal swabs or stool, using the Trizol method or the MiniBEST virus RNA extraction kit from sample extraction RNA products, with the extracted RNA as template, the lateral and medial upstream and downstream primers upstream and downstream primers for RT LAMP reaction, RT LAMP reaction after the end of sampling were detected by agarose gel electrophoresis, in which RT LAMP reaction specific ladder strips judging the detected bird is infected with H9 avian influenza virus.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学领域，涉及一种从禽病料中检测病毒的方法，以及这种方 法的用途。更确切讲，本专利技术利用环介导等温扩增技术而研发的检测方法，从 死禽病料(包括肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝和心等组织)和活禽病料(包 括血液、气管拭子、泄殖腔拭子和粪便)中检测H9型禽流感病毒的方法。
技术介绍
禽流感病毒(AIV) —直是影响养禽业的最主要病原。虽然通过疫苗的广泛 使用，使得禽流感的流行得以控制，但近年来，在我国流行的H9型禽流感在高 免鸡群中呈现流非典型症状，常以产蛋量大幅度下降，低死亡率，呼吸道症状及 后期的神经症状为特征，临床很难区别禽流感病毒的亚型和其他呼吸道病毒病。 因此，对禽流感病毒的检验与诊断方面的研究具有重要意义。流感是呈全球分布的传染病，各个国家都有不同程度的发生。流感对人类 的危害众所周知，它的发病率和造成的死亡人数至今仍列为传染病之首。在畜 牧兽医方面，它也威胁着多种家畜家禽甚至很多珍稀野生动物的繁衍和生存， 从而对经济也造成极大的影响。由于流感病毒的毒株众多，毒力差别很大，所 以临床症状也千差万别。尤其H9型禽流感和其他呼吸道疾病很难与其他有类似 症状的传染病区分，而且临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、病程 长短、并发感染情况及感染毒株毒力等不同而有所不同，可能缺乏特征性症状 和剖检变化，这给H9型流感的诊断和防治带来极大的困难。因此，单靠临床诊 断常常难以定性。实验室诊断是确诊流感的惟一有效途径。特别是随着血清学 实验技术和分子生物学技术的飞速发展，H9型流感诊断技术的研究也不断取得 新的进展。同时，分子生物学的发展为H9型流感病毒核酸序列分析创造了条件。为了确定H9型流感是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完 全可靠，还必须通过病原学检查以确诊病原的存在。H9型流感病毒病原学检查， 一般用生物学实验、血清学诊断技术和分子生物学诊断技术。这些技术方法虽 然得到承认、采纳和应用，但是它们有的敏感性不高、有的特异性不强、有的 检出率较底、有的检测周期太长、有的费用太大，而且这些方法大多都需动用 活病毒，存在向周围环境散毒的隐患。 一般基层单位要开展此项工作，存在不 少困难，特别是被检材料污染，检出更为困难。因此进行H9型病毒的分离鉴定， 不仅需要严格的无菌取材，还需要低温保存，迅速送检，这往往也是一般工作 现场难以办到的。因而建立一种快速诊断该病的方法，己成为H9型流感防治技 术研究的重要课题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种快速、简便、灵敏和经济的用于检测死禽病 料(包括肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝和心等组织)和活禽病料(包括血 液、气管拭子、泄殖腔拭子和粪便)中间检测H9型禽流感病毒的方法。本专利技术是利用环介导等温扩增技术，从禽病料中提取核酸，利用所设计的 引物进行扩增反应,检测反应产物是否含有特异性的梯状条带，以确定禽是否感 染H9型禽流感病毒的快速检测技术。本专利技术以禽病料核酸提取物为模板，所使用的四条特异性引物为表1. RT-LAMP检测方法所使用的引物引物名称 引物序列F 5'-CTACTGTTGGGAGGAAGAGAA丁GGT-3本专利技术的实现方法如下通过使用特异性引物，利用RT-LAMP技术扩增H9 型禽流感病毒基因组上的特定区域，通过检测特定产物的形成与否，从分子水 平对血液或组织样品中的H9型禽流感病毒进行筛查。本专利技术的H9型禽流感病毒的RT-LAMP检测方法是以被检禽病料中的 RNA为模板，根据H9型禽流感病毒基因组序列，设计两对针对H9型禽流感病 毒的//J基因的特异性引物进行等温扩增反应。环介导等温扩增技术是由日本科学家Notomi专利技术的一种的迅速、简便、准 确、成本低的核酸识别技术。RT-LAMP技术用于H9型禽流感病毒的检测具有 如下优点1. 对靶基因的6个部位设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使耙基因 高效扩增，由于其反应是由多个引物共同启动的，所以比RT-PCR更特异。2. RT-LAMP技术比RT-PCR具有更高的灵敏度，但所需设备却十分简单， 仅需一台能提供6(TC左右的水浴锅即可，其试验成本可极大降低。3. RT-LAMP技术一般一个小时内即可完成，比RT-PCR节省时间。 本专利技术中所使用的试剂包括病毒RNA提取试剂和RT-LAMP核酸扩增试剂。诊断方法的步骤如下 (1 ) 核酸提取无菌取病禽血液、气管和泄殖腔拭子或粪便以及死禽的器官组织，最好是 禽的脑、脾和肺等器官组织，用灭菌生理盐水研磨成乳悬液，并每毫升加入青、链霉素各2 000 IU,分装入小瓶贴好标签-8(TC保存备用；分别按照试剂盒说明 采用Trizol方法或MiniBEST病毒RNA提取试剂盒，从血液、咽喉和泄殖腔拭 子以及组织中提取包括病毒基因在内的全基因组RNA;同时，无菌提取健康咽 喉拭子中的RNA，以用作阴性对照。 (2) RT-LAMP反应 RT-LAMP反应体系如下终浓度分别为2.0 |iM的FIP禾P BIP引物，0.2|xM的F禾B B引物，1.0 mM dNTP， 8U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)， lOxbuffer (containing 2 mM of MgS04， 0.8 M betaine ) and 1 jal提取的模 板cDNA，反应终体积为50pl，反应在0.2ml PCR管中进行。RT-LAMP反应程序为恒温水浴锅63。C条件下反应45 min，然后在80°C 加热lOmin终止反应。RT-LAMP反应产物检测和结果判定反应产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳， 10V/cm， 30分钟后溴化乙啶染色后260nm波长观察。。附图说明图1为H9型禽流感病毒的RT-LAMP和RT-PCR检测方法的敏感性比较的 电泳图。从左至右依次为M， DNA分子量标准DL-2000; 1-6泳道，不同拷贝 数的模板进行的RT-PCR反应，分别为每管1， 10, 102, 103, 104, 105拷贝。7-12泳 道，RT-LAMP反应中每管中含有不同拷贝数的模板，分别为每管1, 10， 102, 103， 104， 105拷贝。RT-PCR对H9型禽流感病毒的检出限为100拷贝，而RT-LAMP 的检出方法为10拷贝。具体实施例方式本专利技术实施例分成两部分完成，即实施例一H9型禽流感病毒RT-LAMP方 法的建立；实施例二 H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的特异性和敏感性试验， 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例<一> H9型禽流感病毒RT-LAMP方法的建立1、 H9型禽流感的核酸提取无菌采集感染H9型禽流感病毒的禽外周血液，加入适量抗凝剂，对禽组织 样品加入少量pH7.4， 0.05M的磷酸盐缓冲液(PBS)然后用组织粉碎机匀浆处理。 处理后的样品按照宝生物工程(大连)有限公司提供的病毒RNA提取试剂盒提取 病毒RNA。2、 H9型禽流感的RT-LAMP反应参照GenBank登录的H9型禽流感的/^基因的序列，设计两对引物。本专利技术采用引物的序列如下 外侧引物上游F: 5'- CTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGT-3' 下游B: 5'-GAAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
Ｈ９型禽流感病毒的快速检测技术，其特征是无菌采集被检死禽的肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝或心等组织，或者无菌采集被检活禽的血液、气管拭子、泄殖腔拭子或粪便，采用Ｔｒｉｚｏｌ方法或ＭｉｎｉＢＥＳＴ病毒ＲＮＡ提取试剂盒从所采样品中提取ＲＮＡ，以提取的ＲＮＡ为模板，以外侧上、下游引物和内侧上、下游引物进行ＲＴ－ＬＡＭＰ反应，ＲＴ－ＬＡＭＰ反应结束后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测，以是否出现ＲＴ－ＬＡＭＰ反应特异的梯状条带来判断被检禽是否感染Ｈ９型禽流感病毒，所用的外侧上、下游引物和内侧上、下游引物为：　引物名称　引物序列　Ｆ　５′－ＣＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴ－３　Ｂ　５′－ＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＴＣＣＡＴＡＣＣＡ－３　ＦＩＰ　５′－ＣＴＧＴＡＧＡＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡ ＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＣＡＡＴＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＣＴ－３′　ＢＩＰ　５′－ＴＣＡＡＧＡＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＴＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＴＣＣＡＴＡＣＣＡ－３′。

【技术特征摘要】
1.H9型禽流感病毒的快速检测技术，其特征是无菌采集被检死禽的肠内容物、肺、气囊、肠、脾、肝或心等组织，或者无菌采集被检活禽的血液、气管拭子、泄殖腔拭子或粪便，采用Trizol方法或MiniBEST病毒RNA提取试剂盒从所采样品中提取RNA，以提取的RNA为模板，以外侧上、下游引物和内侧上、下游引物进行RT-LAMP反应，RT-LAMP反应结束后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测，以是否出现RT-LAMP反应特异的梯状条带来判断被检禽是否感染H9型禽流感病毒，所用的外侧上、下游引物和内侧上、下游引物为<tables id=tabl0001 num=0001 ></tables>2.根据权利要求1所述的H9型禽流感病毒的快速检...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永生，陈豪泰，张杰，孙德惠，马丽娜，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]