快速检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种快速检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法。所说的试纸条由标记好对照线和检测线的NC膜、免疫金垫、样品垫、吸水滤纸和PVC底板构成。其中所说的对照线的成分是抗鼠IgG，检测线的成分是抗禽白血病抗原的单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。上述试纸条包括胶体金标记抗体、喷金、制作硝酸纤维素膜和组装的步骤。本发明专利技术的试纸条用于检测样本中的禽白血病抗原，从而可以用于禽白血病检测和诊断。该方法简便、快速，可以用肉眼直接观察，3-10分钟即出结果，适用于基层各级兽医部门和出入境禽白血病的快速大量筛选检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法。
技术介绍
I.胶体金快速诊断技术的原理胶体金(Colloidal gold),是由金离子还原而成的许多单个金颗粒组成的悬乳液，胶体金颗粒是有一个基础的晶核(原子金周围包含有11个金原子的二十面体)及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子(AuC12_)，外层离子层H+则分散在胶体间溶液(见图I)。金颗粒表面所包围的阴性电荷层，叫做zata电位，可以使胶体金颗粒之间相互排斥而使悬浮液保持稳定。胶体金颗粒可以从5_150nm不等，制备胶体金仍基于还原法，常用的有鞣酸、柠檬酸三钠、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等各种有机或无机化合物。还原剂的浓度和还原力越高，那么所合成的胶体金颗粒就越小。胶体金2-5nm是桔黄色，10_20nm是酒红色，大颗粒30-64nm是深红色。小分子的胶体金颗粒基本上是圆球形，30-80nm为偏心圆形。胶体金标记，实质上就是蛋白质等高分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的过程。蛋白质与金颗粒的结合机制大概有以下几个方面带负电荷的金颗粒与蛋白质上的带正电的一些带正电荷的氨基酸反应，如赖氨酸；其次，蛋白质通过疏水作用吸附于金颗粒表面；通过蛋白质中半胱氨酸的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合。在标记后需要加入一定量的稳定剂，常用的稳定剂有牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、明胶和干酪素等封闭金颗粒未被占据的位点以减少非特异性反应并稳定悬胶溶液。胶体金免疫快速诊断技术是在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、层析分析技术、胶体金标记技术和新材料技术基础上完善起来的一项固相标记新型免疫检测技术。胶体金快速诊断技术是以胶体金作为示踪物或显色剂，将胶体金标记在抗体上，再利用抗原抗体的血清学反应原理，把金颗粒连接到抗原上，当抗原抗体反应处达到一定密度时(即金颗粒IO7个/_2)，出现肉眼可见的红色斑点。胶体金标记抗体实质是抗体被吸附到胶体金颗粒表面的过程，且这种吸附属于物理吸附，对抗体的生物活性影响很小，易获得较高的标记率；另外胶体金不属于生物活性物质，干扰检测结果的因素大大减少。目前在检验中的应用主要有2种形式穿流形式,又称为胶体金免疫渗滤试验(Dot-immunogoldfiltration assay, DIGFA);另一种为侧向横流形式，又称为胶体金免疫层析试验(Goldimmunochromatography assay,GICA)。胶体金免疫渗滤试验始于1985年,最初以酶作为标记物。1989年Spielberg以胶体金为标记物成功检测了艾滋病病毒(HIV)抗体，确立了免疫渗滤试验的基本技术，即主要以层析微孔膜(硝酸纤维素膜，称NC膜)为固相载体，在NC膜上固定已知的抗原或抗体，封闭包被后，将其装入免疫渗滤装置(塑料小盒)中，加待测样品，洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体。塑料小盒一般为扁平形，里面装满吸水材料，盒分为底和盖两部分，盖的中央有一直径0. Γ0. 8cm孔，小孔下紧贴吸水垫料放置硝酸纤维素膜。胶体金免疫层析技术原理与免疫渗滤技术基本一致，只是将原来的渗滤改为层析。它同样以硝酸纤维素膜为固相载体，通过毛细管作用使样品溶液在层析条上移动，并同时使样品中的待测物质与层析材料上待测物的受体发生高特异高亲和性的免疫反应。层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过直接可目测的标记物胶体金而得到直观的实验现象(如显色)，而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。2.禽白血病禽白血病病毒可引起禽类各种良性和恶性肿瘤，为反转录病毒科。依据病毒囊膜糖蛋白的抗原性差异、病毒干扰实验、宿主范围和基因组的特性，禽白血病病毒已分类至10个亚群，分别命名为A至J亚群。本病尚无切实可行的治疗方法，也没有有效的疫苗。因此对本病最理想的防制措施是培育无ALV感染鸡群。禽白血病由Roloff于1868年首次报道，之后很快蔓延至世界许多国家，我国于二十世纪五十年代在甘肃首次发现，此后几乎蔓延到了每个省份。近年来，禽白血病在肉仔鸡群中的流行逐渐减少，而在蛋鸡和地方品种中的流行有加重趋势，发病率在5%-20%，给养鸡业带来了极大经济损失和威胁。目前，国内外已经建立了很多禽白血病的检测方法，如酶联免疫吸附试验化1^34)、？0 及1 1'- 0 、原位杂交(ISH)、间接免疫荧光(IFA)等，这些方法各有优缺点。本专利应用两株抗ALV P27蛋白的特异性单克隆抗体5D3和4F12研制了 ALV快速检测试纸条，证明该试纸条能够快速、准确地检测ALV病毒抗原，具有良好的特异性和较高的灵敏性。培育无ALV感染鸡群时，首先对母鸡检测其蛋清中的P27抗原，选择不排泄ALV的母鸡的种蛋孵化，然后对孵出的仔鸡检测其泄殖腔拭子中的P27抗原。淘汰抗原和抗体阳性鸡，集中抗原和抗体阴性鸡于洁净的环境中饲养，并在生长期中及性成熟时，再对所有ALV亚群进行病毒抗原和抗体的检查，这样可逐步建立起无ALV感染鸡群。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法。本专利技术所采用的技术方案是一种快速检测禽白血病抗原的试纸条由标记好对照线和检测线的NC膜、免疫金垫、样品垫和吸水滤纸和PVC底板构成，依次将NC膜、免疫金垫、样品垫和吸水滤纸依次粘贴在PVC底板上，并且它们的接头处有叠压，使层析能顺利进行；其中所说的对照线的成分是抗鼠IgG，检测线的成分是抗禽白血病抗原的单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。上述的试纸条可以和塑料卡组成更便于使用的试纸条，所说的塑料卡分为底座和面盖两部分；底座上有一个放试纸条的固定槽以及与面盖嵌合的卡齿；面盖有一个加样孔和一个观察窗以及与底座嵌合的卡齿；观察窗旁边分别印有字母T和C，T表示检测线，在近加样孔一侧，C表不对照线,在远加样孔一侧。本专利技术的快速检测禽白血病抗原的试纸条可通过以下步骤制备(I)胶体金标记抗体在胶体金上标记抗禽白血病抗原特异性单克隆抗体；、(2)喷金将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫；(3)制作硝酸纤维素膜将兔抗鼠IgG和抗禽白血病抗原的单克隆抗体4F12分别喷到硝酸纤维素膜上，制成对照线和检测线；(4)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装在PVC底板上，然后切条得试纸条。上述方法中，所说的抗禽白血病抗原的单克隆抗体为筛选优化后的特异性单克隆抗体5D3和4F12。 本专利技术的试纸条能用于检测泄殖腔棉试、病料悬液、蛋清、细胞培养等材料样本中 的病毒抗原，从而对禽白血病进行诊断。该方法简便、快速，可以用肉眼直接观察，3-10分钟即出结果，适用于基层各级兽医部门、家禽育种公司和出入境禽白血病的快速大量筛选检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。附图说明图I.胶体金颗粒结构。图2.试纸条组装示意图；I-PVC底板；2_样品垫；3_免疫金垫；4_NC膜；5_吸水垫；T_检测线；C_对照线。图3.试纸条检测结果图解。图4.试纸条特异性试验。具体实施例方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实例，并参照数据进一步详细地本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦爱建，钱琨，梁有志，尹丽萍，邵红霞，金文杰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：