一种植物耐铅蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物耐铅蛋白及其编码基因与应用。植物耐铅蛋白是序列表中ＳＥＱＩＤＮｏ：２，其编码基因是序列表中ＳＥＱ？ＩＤ？Ｎｏ：１ＤＮＡ序列。本发明专利技术利用该耐铅蛋白的编码基因增强植物对铅的耐受性，为农作物耐铅育种和降低农作物的铅积累提供基因与技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域中一个植物耐铅相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及利用该基因增强植物对铅毒害耐受的方法。二
技术介绍
重金属污染问题是当今世界所面临的重要难题之一。由于人类对重金属的开采、 冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如镉、铅、汞、钴等进入大气、水、土壤 中，引起严重的环境污染。重金属，特别是镉、铅、汞、铬等具有显著的生物毒性。它们在水 体中不能被微生物降解，而只能发生各种形态相互转化和分散、富集过程(即迁移)，并经 过食物链为人体摄取和积累。进入人体的重金属，尤其是有害的重金属，有的会在人体内积 累和浓縮，如果超过人体所能耐受的限度，可造成人体急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒等 危害。所以提高作物对重金属的耐受和降低对重金属的吸收已经成为关系民生的大事，已 成为农业生产和食品安全进一步研究的重点，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是 当前生命科学研究的热点。 拟南芥是一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究 领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其 它植物研究。因此，对拟南芥抗重金属毒害分子生物学机制的研究对特定区域提高作物的 产量和增加食品安全性具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南 芥测序数据库(www.arabidopsis.org)寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是 国际植物学研究领域的热点之一，也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3 亿个碱基对，2. 9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能 已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究，发现了一些与植物相关的耐受重金属基因 的功能，如AtATM3， ACBP， AtPDRl， AtPDR12等。 面对日益严重的环境污染问题，寻找耐受重金属并且能降低作物中重金属含量的 功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。根据拟南芥数据库公布的基因组序 列，MYB61(Atlg09540)是一个与气孔调节和种子黏液排出密切相关的基因，是拟南芥MYB 转录因子家族中的成员。申请人发现铅处理MYB61基因敲除植株表现为对铅耐受，这表明 该基因涉及铅耐受性的调控。为此，我们研究了该基因功能，研究结果表明MYB61基因功能 缺失可以导致拟南芥中铅离子转运蛋白AtPDR12编码基因的表达增加从而使植株体内的 铅含量下降，进而表现对铅耐受。三
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的植物耐铅及降低植物铅吸收的相关蛋白及其 编码基因。本专利技术所提供的植物耐铅及降低植物铅吸收相关蛋白的编码基因，名为 MYB61(AT1G09540)，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列 之一的蛋白质 (1)序列表中的SEQ ID No :2 ; (2)将序列表中SEQ ID No :2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且与植物耐铅相关的蛋白质。 序列表中的序列2由366个氨基酸残基组成。 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。 MYB61的编码基因也属于本专利技术的保护范围。MYB61的cDNA基因，选自下述核甘酸序列之一 ； (1)序列表中SEQ ID No :1的DNA序列; (2)编码序列表中SEQ ID No :2蛋白质序列的多核苷酸； (3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No :1限定的DNA序列杂交的核甘酸序 列； (4)与序列表中SEQ ID No :1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且编码相同 功能蛋白质的DNA序列。 序列表中的序列1由1498个碱基组成，其开放阅读框架(0RF)为自5'端第175 位至1275位碱基，编码序列SEQ ID No :2的蛋白质。 含有本专利技术MYB61的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本专利技术的保护范围。扩增 MYB61中任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。 本专利技术的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物耐铅及降低植物中铅含量 的方法。 本专利技术所提供的增强植物耐铅及降低植物中铅含量的方法，是抑制植物中的上述 植物耐铅及降低植物中铅含量相关蛋白编码基因的表达。 抑制植物中的上述植物耐铅相关蛋白编码基因MYB61的表达可通过多种方法实 现，如植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法，siRNA介导的基 因沉默方法等。本专利技术抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制MYB61表 达均可。 利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除(或沉默)后，植物表现为耐铅。 本专利技术的MYB61基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核 苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进 行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素 酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可 以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪 草或苜宿等。携带有本专利技术MYB61基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒 载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织， 并将转化的植物经组织培育成植株。 本专利技术的植物耐铅相关蛋白及其编码基因可为农作物耐铅育种和降低农作物中 的铅含量提供基因与技术的支持(保障)。 下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明。4四附图说明 图1为突变体myb61-l与野生型植株竖立培养，直接点种于含有或不含有铅的 培养基上在正常光照培养条件下竖直2周的比较照片(A 1/2MS;B 500iiM Pb(N03)2;C 750 ii MPb (N03) 2 ;D根长;E鲜重)。 图2为突变体myb61-l和野生型植株竖立培养，直接点种于含有或不含有铅的培 养基上在正常光照培养条件下竖直3周的比较照片(A 1/2MS;B 0.8mM Pb(N03)2)。 图3为突变体myb61-l和野生型植株在0. 5mM铅处理条件下铅含量的比较。 图4为突变体myb61-l和野生型植株在MS和0. 5mM铅处理条件下相关基因的表 达水平。五具体实施例方式下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。 实施例1 、 MYB61及其编码基因的获得 以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗约50-100mg为材料，用Trizol提 取其总RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度。按RevertAidTM First Strand cDNA SynthesisKit(Fermentas公司)试剂盒说明书，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条 链。以提取出来的第一条链cDNA为模板，进行如下PCR反应20 iU反应体系，内含10 X PCR 缓冲液2iil，dNTPs(10mM)混合物0. 4 yl，引物1和引物2各2 yl， Tag酶(5U/yl) 0. 2 yl ， 其余加双蒸水至20 ii 1 。其中，引物1 :F 5， ATGGGGAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物耐铅蛋白，其特征在于：氨基酸残基序列如序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２所示。

【技术特征摘要】
一种植物耐铅蛋白，其特征在于氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No2所示。2. 根据权利要求l所述的蛋白，其特征在于SEQ ID No :2的氨基酸残基序列包括不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺少和/或添加。3. 由权利要求1所述的植物耐铅蛋白的编码基因，其特征在于选自下列核苷酸下列之一 (1) 序列表中SEQ ID No :1的DNA序列;(2) 编码序列表中SEQ ID No :2蛋白质序列的多核苷酸。4. 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于在高严谨条件下与SEQ ID No:l...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹树青，任永兵，江力，袁怀波，孙佳佳，汪洋，宗凯，吕申超，孙泽华，文辰，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]