【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体是一种荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold及其应用。
技术介绍
1、l-苏氨酸是人体必需氨基酸之一，在食品、医药、饲料等领域都有着广泛应用。微生物发酵是目前工业生产l-苏氨酸的主要方法，因此高产菌株的高通量选育成为行业的关注重点。目前，l-苏氨酸的工业生产菌株已经进行了较为深度的诱变改造，经过深度诱变改造后的生产菌株中各酶表达量已经形成了良好的平衡，但缺乏了与之高度适配的细胞底盘，致使l-苏氨酸产量的提升陷入瓶颈。因此，建立一种筛选标记并将其应用于l-苏氨酸生产菌株高通量筛选对于解决现有问题很有必要。
2、l-苏氨酸生产菌株的高通量筛选依赖于荧光信号，将检测到的荧光信号数字化，这些数字可用于分析细胞的荧光特性，例如荧光强度的分布、荧光峰值的位置和形状等特性。通常，可采用荧光染料染色、表达荧光蛋白和添加荧光标记底物等方法使细胞携带荧光信号，其中：常用的荧光染料包括小分子有机染料、量子点、藻胆蛋白和荧光示踪染料(核酸染料、细胞质染料和膜结合染料)等；细胞表达的不外泌荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(bfp)、青色荧光蛋白(cfp)、绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)及其各种衍生物，如egfp、super-folder gfp、ecfp和eyfp等；添加荧光标记底物的方法现有报道较多，比如公布号为“cn115725628a”(申请号：202211358122.9)的中国专利申请中公开了一种内含肽偶联荧光蛋白质粒体系，所述质粒中包含荧光蛋白-n-内含肽-n端蛋白的
3、目前，针对l-苏氨酸生产菌株所研发的筛选标记较少，本专利技术拟构建一种荧光蛋白筛选标记并将其应用于l-苏氨酸生产菌株的高通量筛选，以快速筛选出l-苏氨酸高产菌株。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold及其应用，可将该荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold应用于l-苏氨酸生产菌株的筛选中，能够明显提高l-苏氨酸生产菌株的筛选效率。
2、本专利技术技术方案如下：
3、一种荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
4、优选的，所述荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold的构建方法，包括如下步骤：
5、(1)通过ncbi数据库查找绿色荧光蛋白egfp的编码基因staygold，其核苷酸序列如seq id no.1所示；从谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)的基因组中筛选出基因gbt2，并将基因gbt2中l-苏氨酸的密码子全部使用稀有密码子act替换，得gbt2改造基因，gbt2改造基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；
6、(2)通过柔性连接肽将基因staygold与gbt2改造基因连接，得荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
7、其中，所述基因gbt2所编码的氨基酸序列中l-苏氨酸占比较高，为17.4％。本专利技术将基因gbt2中l-苏氨酸的密码子全部使用稀有密码子act替换，得gbt2改造基因；稀有密码子的翻译受相应稀有trna的影响，稀有trna的低丰度显著减慢了l-苏氨酸的表达。将gbt2改造基因与基因staygold连接得到荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold后，当环境中l-苏氨酸浓度较高时，稀有密码子识别l-苏氨酸并在氨酰trna合酶的作用下与l-苏氨酸结合，恢复含有稀有密码子的gbt2-staygold的表达，gbt2-staygold的表达变快，相同时间内，荧光蛋白的表达量更多，荧光强度更高，即可通过荧光强度来确认待筛选菌株生产l-苏氨酸的能力。
8、一种重组质粒，包含所述荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold。
9、优选的，所述重组质粒以pet-22b(+)质粒为表达载体。
10、优选的，所述重组质粒的核苷酸序列如seq id no.4所示。
11、所述荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold或所述重组质粒在筛选l-苏氨酸生产菌株中的应用。
12、一种筛选l-苏氨酸生产菌株的方法，是将所述重组质粒导入到待筛选菌株中，得重组菌株；将重组菌株接种至培养基中进行培养，得培养液，根据培养液的荧光强度即可确认待筛选菌株生产l-苏氨酸的能力。
13、优选的，可结合高效液相色谱法对筛选出的荧光强度较高的l-苏氨酸生产菌株进行验证。
14、有益效果：本专利技术提供了一种荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold，可将该荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold应用于l-苏氨酸生产菌株的筛选中，通过待筛选菌株发酵液的荧光强度即可快速筛选出l-苏氨酸高产菌株，该方法能够明显提高l-苏氨酸生产菌株的筛选效率，且节约筛选时间和成本。
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1.一种荧光蛋白筛选标记基因GBT2-staygold，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.权利要求1所述荧光蛋白筛选标记基因GBT2-staygold的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.一种重组质粒，其特征在于，包含权利要求1所述的荧光蛋白筛选标记基因GBT2-staygold。
4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，以pET-22b(+)质粒为表达载体。
5.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.权利要求1所述荧光蛋白筛选标记基因GBT2-staygold或权利要求3所述重组质粒在筛选L-苏氨酸生产菌株中的应用。
7.一种筛选L-苏氨酸生产菌株的方法，其特征在于，是将权利要求3所述重组质粒导入到待筛选菌株中，得重组菌株；将重组菌株接种至培养基中进行培养，得培养液，根据培养液的荧光强度即可确认待筛选菌株生产L-苏氨酸的能力。
【技术特征摘要】
1.一种荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.3所示。
2.权利要求1所述荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.一种重组质粒，其特征在于，包含权利要求1所述的荧光蛋白筛选标记基因gbt2-staygold。
4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，以pet-22b(+)质粒为表达载体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：王松江，杨露，郭传庄，王建彬，杨翠平，汪俊卿，
申请(专利权)人：东晓生物工程山东有限公司，
类型：发明
国别省市：
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