【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体而言，涉及具有casrx活性的突变体及其应用。
技术介绍
1、2016年，科学家发现了可以靶向rna进行切割的crispr/cas13系统，该系统由单一的效应蛋白cas13和crispr rna(crrna)组装形成一个由crrna引导的rna靶向效应复合物。目前，cas13家族共鉴定出四种亚型，包括cas13a(又名c2c2)、cas13b、cas13c和cas13d。其中，crispr/cas13d(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated protein 13d)核酸酶在2018年有研究发现cas13d平均大小约为930aa，是目前发现的哺乳动物细胞中相对较小的ⅱ类crispr效应因子(比其家族成员cas13a-c小20％，比cas9小33％)，使它更容易包装到容量有限的应用载体如aav载体中，cas13d对rna靶点的切割不依赖于pfs序列(protospacer flanking sequence，相当于cas9针对dna的pam序列)，这极大的增加了cas13d的应用范围，使其成为进一步开发靶向rna工具的潜在平台，可以在多种物种、不同的细胞中以及动物体内实现了有效的基因编辑。
2、所有的cas13蛋白酶都需要crrna来确保其结合靶ssrna的特异性，并在crrna的引导下发挥其核糖核酸酶(rnase)活性。crrna通常由直接重复(direct repeat，dr
3、rna编辑器和dna编辑器有着最大不同是rna编辑器不改变遗传物质dna，与cas9介导的基因敲除技术相比，cas13d介导的基因沉默不会改变基因组dna，这种基因沉默是可逆的，安全性更好，因此在基因治疗领域具有广阔的治疗前景。
4、但已有研究表明，单个碱基错配几乎不影响野生型cas13d酶活。因此cas蛋白酶家族通常不能用于单碱基错配导致的遗传疾病的治疗。单碱基突变占所有遗传病的40％以上。如遗传性心肌病、镰刀状贫血、地中海贫血、血友病、早衰症、苯丙酮尿症、糖原累积病、i型糖尿病、家族性高胆固醇血症、高甘油三脂血症、克拉伯病、戈谢病、色盲、遗传性耳聋，进行性肌营养不良以及各种由单碱基突变导致的肿瘤等。遗传性心肌病(inheritedcardiomyopathy)是主要由肌节基因和代谢相关基因突变导致的心肌损伤或功能失代偿性疾病。发病率约为1/200，是青少年猝死的主要原因。按照心肌的形态和功能变化可以粗略分为肥厚性心肌病、扩张性心肌病、限制性心肌病、致心律失常型右室心肌病等。目前已确认的致病突变超过1000种，其中约40％为肌球蛋白β-mhc(myh7)基因上的错义突变，这些肌球蛋白上的氨基酸突变影响了肌节的收缩和舒张功能。
技术实现思路
1、在本专利技术的一个方面，涉及具有casrx活性的突变体，其与seq id no：1所示的氨基酸序列具体至少90％的序列同一性，并且参照seq id no：1的氨基酸位置变化，具有位于下列位置处中的一个或多个突变：
2、k323、n324、g326、r333、n348、k350、k411、y415、t486、r529、k585、r601、y604、n641、r648以及y649。
3、在本专利技术的另一个方面，涉及分离的多核苷酸，其编码权利要求1～8任一项所述的突变体。
4、在本专利技术的又一个方面，涉及一种分子系统，其为复合物或组合物，包含(a)如上所述的突变体和(b)向导rna分子(grna)的集合。
5、在本专利技术的又一个方面，涉及编码如上所述的分子系统的核酸构建体。
6、在本专利技术的又一个方面，涉及一种载体，其包含如上所述的多核苷酸，或如上所述的核酸构建体。
7、在本专利技术的又一个方面，涉及一种递送系统，其包含i)如上所述的分子系统，以及ii)递送媒介物。
8、在本专利技术的又一个方面，涉及一种药物组合物，其包含如上所述的递送系统以及药学上可接受的赋形剂。
9、在本专利技术的又一个方面，涉及一种试剂盒，其包含：如上所述的突变体、或如上所述的分子系统、或如上所述的载体、或如上所述的递送系统、或如上所述的药物组合物，以及任选的该试剂盒的使用说明书。
10、在本专利技术的又一个方面，涉及如上所述的突变体、或如上所述的分子系统、或如上所述的载体、或如上所述的递送系统在制备用于治疗基因变异所引起的疾病的药物中的应用；其中所述疾病由包含一个或多个单碱基突变的变异所引起，或者可通过敲减或敲除某个基因得到治疗。
11、在本专利技术的又一个方面，涉及一种分子系统，其为复合物或组合物，包含如上所述的突变体和向导rna分子(grna)的集合，其中所述grna的核苷酸序列如seq id no：44～173任一项所示。
12、在本专利技术的又一个方面，涉及如上所述的分子系统在制备用于治疗myh7突变导致的心肌病的药物中的应用。
13、本专利技术的这些和其他方面将在以下本专利技术的描述中更详细地进行阐述。
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1.具有CasRx活性的突变体，其与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具体具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％的序列同一性，并且参照SEQ ID NO：1的氨基酸位置变化，具有位于下列位置处中的一个或多个突变：
2.根据权利要求1所述的突变体，其具有位于下列位置处中的一个或两个突变：
3.根据权利要求2所述的突变体，其具有下述突变中的一个或两个：
4.根据权利要求1所述的突变体，其具有下述位置处的突变：
5.根据权利要求4所述的突变体，其具有下述突变N641A、T486A和R648A，优选其为SEQID NO：2所示。
6.根据权利要求1～5任一项所述的突变体，其具有显著提高的区分单碱基突变相关的突变型和野生型转录本的能力。
7.根据权利要求6任一项所述的突变体，其与向导RNA分子(gRNA)所组成的复合物与靶RNA的结合不稳定性提高。
8.根据权利要求6所述的突变体，其具有显著减少的核酸识
9.分离的多核苷酸，其编码权利要求1～8任一项所述的突变体。
10.权利要求9所述的多核苷酸，其包含调控元件，且所述调控元件与编码所述突变体的部分可操作地关联。
11.权利要求9或权利要求10所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸经密码子优化以在生物体中表达。
12.权利要求11所述的多核苷酸，其中所述生物体是动物、植物、真菌、古细菌或细菌。
13.一种分子系统，其为复合物或组合物，包含(a)权利要求1～8任一项所述的突变体和(b)向导RNA分子(gRNA)的集合。
14.编码权利要求13所述的分子系统的核酸构建体。
15.载体，其包含权利要求9～12任一项所述的多核苷酸，或权利要求14所述的核酸构建体。
16.根据权利要求15所述的载体，其是病毒载体。
17.根据权利要求16所述的载体，其是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。
18.根据权利要求17所述的载体，所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、rh10、AAVDJ、AAV-PHP.S、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB和Anc80。
19.递送系统，其包含i)权利要求13所述的分子系统，以及ii)递送媒介物。
20.根据权利要求19所述的递送系统，所述递送媒介物包括一种或多种脂质体、一种或多种外泌体、一种或多种微囊泡、一种或多种树状大分子、一种或多种无机纳米粒子、一种或多种细胞穿膜肽、基因枪、一种或多种质粒、一种或多种病毒载体，以及它们所组成的组。
21.根据权利要求20所述的递送系统，所述病毒载体如权利要求17或18所定义。
22.药物组合物，其包含权利要求19～21任一项所述的递送系统以及药学上可接受的赋形剂。
23.试剂盒，其包含：权利要求1～8任一项所述的突变体、或权利要求13所述的分子系统、或权利要求15～18任一项所述的载体、或权利要求19～21任一项所述的递送系统、或权利要求22所述的药物组合物，以及任选的该试剂盒的使用说明书。
24.一种改变基因产物表达的方法，包括使用CRISPR-Cas核酸酶体系切割靶RNA引入细胞的步骤；
25.权利要求1～8任一项所述的突变体、或权利要求13所述的分子系统、或权利要求15～18任一项所述的载体、或权利要求19～21任一项所述的递送系统在制备用于治疗基因变异所引起的疾病的药物中的应用；其中所述疾病由包含一个或多个单碱基突变的变异所引起，或者可通过敲减或敲除某个基因得到治疗。
26.根据权利要求25所述的应用，所述疾病选自如下疾病中的一种或多种：
27.根据权利要求25所述的应用，所述疾病选自如下疾病中的一种或多种：亨廷顿舞蹈症、帕金森综合症和Rett综合征。
28.根据权利要求26所述的应用，所述疾病为遗传性心肌病，且所述分子系统、或所述的载体、或所述的递送系统中gRNA的间隔序列与SEQ ID NO：3～37任一项所示序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少...
【技术特征摘要】
1.具有casrx活性的突变体，其与seq id no：1所示的氨基酸序列具体具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％的序列同一性，并且参照seq id no：1的氨基酸位置变化，具有位于下列位置处中的一个或多个突变：
2.根据权利要求1所述的突变体，其具有位于下列位置处中的一个或两个突变：
3.根据权利要求2所述的突变体，其具有下述突变中的一个或两个：
4.根据权利要求1所述的突变体，其具有下述位置处的突变：
5.根据权利要求4所述的突变体，其具有下述突变n641a、t486a和r648a，优选其为seqid no：2所示。
6.根据权利要求1～5任一项所述的突变体，其具有显著提高的区分单碱基突变相关的突变型和野生型转录本的能力。
7.根据权利要求6任一项所述的突变体，其与向导rna分子(grna)所组成的复合物与靶rna的结合不稳定性提高。
8.根据权利要求6所述的突变体，其具有显著减少的核酸识别结构域与核酸酶结构域之间的负相关性；其中所述核酸识别结构域包括helical1结构域，所述核酸酶结构域包括helical2和hepn结构域。
9.分离的多核苷酸，其编码权利要求1～8任一项所述的突变体。
10.权利要求9所述的多核苷酸，其包含调控元件，且所述调控元件与编码所述突变体的部分可操作地关联。
11.权利要求9或权利要求10所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸经密码子优化以在生物体中表达。
12.权利要求11所述的多核苷酸，其中所述生物体是动物、植物、真菌、古细菌或细菌。
13.一种分子系统，其为复合物或组合物，包含(a)权利要求1～8任一项所述的突变体和(b)向导rna分子(grna)的集合。
14.编码权利要求13所述的分子系统的核酸构建体。
15.载体，其包含权利要求9～12任一项所述的多核苷酸，或权利要求14所述的核酸构建体。
16.根据权利要求15所述的载体，其是病毒载体。
17.根据权利要求16所述的载体，其是腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。
18.根据权利要求17所述的载体，所述aav载体选自由以下组成的组：aav 1型、aav 2型、aav 3型、aav 4型、aav 5型、aav 6...
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