【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微流控转基因检测芯片，具体涉及基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法。
技术介绍
1、随着人类社会的发展和科技的进步，转基因技术成为了现代农业领域的重要研究方向之一，近几年快速发展的恒温扩增技术，摆脱了对大型设备和专业人员的依赖，已广泛应用于转基因农产品的相关检测工作中，环介导等温扩增技术是日本公司于1998年设计的一种新型高效核酸恒温扩增技术，能够在60～65℃恒温条件下，使用4～6条特异性引物集(针对靶基因6个不同区域设计)，在链置换dna聚合酶的作用下实现核酸快速高效特异的扩增，这种扩增效率高，使得lamp在转基因检测中具有较高的特异性和灵敏性，仅需要水浴锅就可以实现，操作更为简便，更适用于基层实验室或养殖单位进行早期筛查诊断；微流控技术起源于20世纪90年代，是一种在微米尺度上操纵和处理流体以达到化学或生物实验的技术，微流控技术具有精确操控液体、节约试剂消耗量、集成化化程度高等优势，同时，封闭式的微流控芯片可以避免样本的交叉污染，减小生物危害，在分子诊断上的应用有着天然优势，目前已被广泛地用于解决各种生物技术研究问题，如细胞培养、类器官研究、核酸检测等，在改进诊断和生物学研究方面显示出相当大的前景。
2、现有的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法不能通过基于微流控芯片技术与环介导等温扩增技术相结合的多价转基因成分检测芯片，实现对转基因植物及其相关产品中转基因成分精准、快速的鉴别。
技术实现思路
1、本专利技术的
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，具体检测方法步骤如下：
3、步骤一：通过含bar基因的质粒合成，酶切与连接反应，感受态细胞的制备，重组质粒的转化，基因组的提取，进行植物及其产品中dna的提取；
4、步骤二：优化转基因检测相关基因的lamp扩增引物，将转bar基因玉米、转bt基因玉米、转badh抗虫基因玉米、普通玉米，提取基因组，在试剂加样量不变、使用上述实验的最佳反应温度、反应时间，进行lamp扩增检测其特异性，反应完成后运用荧光实时lamp进行验证；
5、步骤三：以上述实验获得的阳性质粒为模板，与筛选所得的特异性引物进行lamp反应，并对其中的2个因素进行优化，分别是lamp反应温度和lamp反应时间；
6、步骤四：芯片图案的绘制以及掩膜的打印方法如下：在coreldraw x7软件上绘制和设计芯片的实际尺寸图形，并使用5000dpi打印机打印高分辨率菲林掩膜，首先制作通道层，厚度为50μm；其次，制作腔室层，厚度为100μm(叠加上原本的通道层厚度，实际腔室层的厚度约为150μm)，操作与通道层类似；
7、步骤五：dcd-chip的制作并进行利用台阶仪检测模具上腔室高度从而得到芯片的腔室高度，腔室的直径通过显微成像后利用显微镜自带的测量软件分析得到，测量个数为100，腔室的体积根据圆柱体积公式计算：v＝πr2h；
8、步骤六：利用光导合成反应的原理，以经过修饰具有5′末端带光敏保护基团的亚磷酰胺(a、g、c、t)为原料，根据需要合成的核苷酸序列，用特制的光刻掩膜或者用激光定时定点地控制载体上光照的位点，从而指导寡核苷酸探针在片基上的合成，制成转基因芯片；
9、步骤七：芯片的检测性通过数字pcr阴阳性小室区分效果以及定量性能两方面验证，数字pcr阴阳性小室区分效果通过统计阴性和阳性小室的荧光强度的均一性和信噪比验证；dcd-chip的定量性能通过对不同浓度拷贝数的模板进行双重数字pcr反应，并分析加样浓度和检测浓度之间的线性关系来验证。
10、进一步的；所述步骤六中制备转基因芯片前需要载体活化，用于制备基因芯片常用的活化方法主要是将载体表面修饰成与核酸的羟基能有效偶联的状态，常用的修饰方法为多聚赖氨酸法和醛基-氨基法。
11、进一步的；所述步骤一中基因组的提取包括改良ctab法、尿素提取法、月桂酰肌氨酸钠法、n-月桂酰肌氨酸钠-改良ctab法。
12、进一步的；所述步骤三中设置反应水浴温度60℃，62.5℃，63.5℃，65℃，条件下进行检测，以确定其最适反应温度，反应水浴时间为0min，5min，10min，15min按照其反应体系进行反应，并通过可视化og橙绿变色管和采用实时荧光定量pcr仪器进行lamp反应验证，从而优化出最佳的lamp反应体系。
13、进一步的；所述步骤二中最佳反应温度63.5℃和最佳反应时间10min条件下，进行特异性验证，采用转bar基因、转bt基因、转badh抗虫基因和普通玉米基因。
14、进一步的；所述步骤五中dcd-chip的制作包括配置预聚物、制作模具围栏、倾倒预聚物、揭芯片、切割并打孔、封接、恢复疏水性、贴胶带层。
15、进一步的；所述步骤四中制作通道层的步骤包括调平、清洗硅片、干燥、旋涂光胶、光胶流平、前烘、曝光、后烘；制作腔室层的步骤包括旋涂光胶、光胶流平、前烘、曝光、后烘、显影、硬烘、模具表面处理。
16、进一步的；所述步骤七中通过用gpr146基因的数字pcr荧光图像、rpph1基因的数字pcr荧光图像，对图像中的阴性和阳性小室荧光强度进行分析，gpr146和rpph1基因在dcd-chip中的定量性能。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
18、(1)基于微流控芯片技术与环介导等温扩增技术相结合的多价转基因成分检测芯片，实现对转基因植物及其相关产品中转基因成分精准、快速的鉴别，作为一种新型的核酸等温扩增技术，lamp技术具有反应条件简单、操作方便，检测结果可视化等优势，尤其是不依赖pcr扩增仪的优点，更适合于现场即时检测，但lamp技术很难实现在一个反应体系中对多重目标物的同时检测以及定量检测，微流控技术通过将一个生物或化学实验室微缩到一块几平方厘米的薄片上，有效解决了lamp技术的不足之处。
19、(2)该基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，使芯片可在达到高灵敏度基础上，将两种或两种以上转基因成分呈现在一个检测芯片上，达到微型化、芯片化、集成化和高通量化转基因检测的需求，而且芯片整合了自吸式pdms芯片无动力源顺序进样的优势，无需任何外接的驱动设备便可买现样品的自动引入，大大提高了微流控装置的便携性。
20、(3)该基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，结合上述优势，本项目开发的自吸多价核酸扩增微流控芯片可移动性高，使用方便，非常适用于样品现场检测和稀本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于，具体检测方法步骤如下：
2.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤六中制备转基因芯片前需要载体活化，用于制备基因芯片常用的活化方法主要是将载体表面修饰成与核酸的羟基能有效偶联的状态，常用的修饰方法为多聚赖氨酸法和醛基-氨基法。
3.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤一中基因组的提取包括改良CTAB法、尿素提取法、月桂酰肌氨酸钠法、N-月桂酰肌氨酸钠-改良CTAB法。
4.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤三中设置反应水浴温度60℃，62.5℃，63.5℃，65℃，条件下进行检测，以确定其最适反应温度，反应水浴时间为0min，5min，10min，15min按照其反应体系进行反应，并通过可视化OG橙绿变色管和采用实时荧光定量PCR仪器进行LAMP反应验证，从而优化出最佳的LAMP反应体系。
5.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤二中最佳反应温度63.5℃和最佳反应时间10min条件下，进行特异性验证，采用转Bar基因、转Bt基因、转Badh抗虫基因和普通玉米基因。
6.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤五中DCD-chip的制作包括配置预聚物、制作模具围栏、倾倒预聚物、揭芯片、切割并打孔、封接、恢复疏水性、贴胶带层。
7.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤四中制作通道层的步骤包括调平、清洗硅片、干燥、旋涂光胶、光胶流平、前烘、曝光、后烘；制作腔室层的步骤包括旋涂光胶、光胶流平、前烘、曝光、后烘、显影、硬烘、模具表面处理。
8.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤七中通过用GPR146基因的数字PCR荧光图像、RPPH1基因的数字PCR荧光图像，对图像中的阴性和阳性小室荧光强度进行分析，GPR146和RPPH1基因在DCD-chip中的定量性能。
...【技术特征摘要】
1.基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于，具体检测方法步骤如下：
2.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤六中制备转基因芯片前需要载体活化，用于制备基因芯片常用的活化方法主要是将载体表面修饰成与核酸的羟基能有效偶联的状态，常用的修饰方法为多聚赖氨酸法和醛基-氨基法。
3.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤一中基因组的提取包括改良ctab法、尿素提取法、月桂酰肌氨酸钠法、n-月桂酰肌氨酸钠-改良ctab法。
4.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增的自吸式多价微流控转基因检测芯片的方法，其特征在于：所述步骤三中设置反应水浴温度60℃，62.5℃，63.5℃，65℃，条件下进行检测，以确定其最适反应温度，反应水浴时间为0min，5min，10min，15min按照其反应体系进行反应，并通过可视化og橙绿变色管和采用实时荧光定量pcr仪器进行lamp反应验证，从而优化出最佳的lamp反应体系。
5.根据权利要求1所述的基...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐亚维，王俊玲，孙旭哲，刘喜东，李珊珊，王尧，邓川，
申请(专利权)人：吉林农业科技学院，
类型：发明
国别省市：
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