【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物发光探针，具体涉及一种检测细胞色素p450环氧合酶2j2的生物发光探针，还涉及上述生物发光探针的制法和应用。
技术介绍
1、近年来，细胞色素p450环氧合酶2j2(cyp 2j2)作为一种生物体内重要的代谢酶，已受到众多学者的广泛关注。大量研究表明，cyp 2j2能够高效的将人体多种内源性多聚不饱和脂肪酸代谢为信号分子花生四烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，eets)，生成的eets又可进一步促进正常细胞的分化和增殖进而维持多种生理功能。此外，最新研究发现，多种肿瘤细胞(如：hepg-2、a549等)中的cyp 2j2含量远高于正常组织。肿瘤细胞中高表达的cyp2j2可以促进肿瘤细胞的增殖并且可以使肿瘤细胞免于凋亡。此外，cyp 2j2还可通过产生多种促血管生成的脂类物质诱导原发性癌症及癌旁组织内血管生成，进而促进肿瘤细胞的转移。然而，目前cyp 2j2和肿瘤相关性的研究还处于初级阶段，且市场上可用于cyp 2j2的抗癌药物也相对匮乏。因此，开发一种高灵敏度、高选择性、高对比度的新型cyp 2j2响应型探针用于实时监测，在病理研究、新药研发、药效学评价以及疾病诊断等领域有着广阔的应用前景。
2、为了实现cyp 2j2的有效监测，目前已经有多种方法被相继报道，如：质谱法、高效液相色谱法以及荧光法。其中质谱法和高效液相色谱法无法实时追踪内源性cyp 2j2在各种生理和病理条件下的功能性变化。荧光法作为一种光学成像手段，由于其高灵敏性、操作简易性和非侵袭性等优点，已被广泛用于c
技术实现思路
1、专利技术目的：为了克服现有技术，尤其荧光探针在cyp 2j2酶检测中的缺点，本专利技术基于生物发光的成像特点，提供一种可用于实时、高灵敏度、高选择性、高对比度的检测细胞色素p450环氧合酶2j2的生物发光探针，还提供上述生物发光探针的制法和应用。
2、技术方案：本专利技术的检测细胞色素p450环氧合酶2j2的生物发光探针，化学结构式如式(i)：
3、
4、上述的生物发光探针的制备方法，包括以下步骤：
5、(1)将化合物ii、4-甲氧基溴苄和无水碳酸钾溶于有机溶剂中，在氩气保护下搅拌进行反应，即得到中间产物化合物iii；
6、(2)将化合物iii和d-半胱氨酸盐酸盐在溶剂中在室温下进行反应，即得所述检测细胞色素p450环氧合酶2j2的生物发光探针pj-luc；
7、
8、其中，步骤(1)所述化合物ii、4-甲氧基溴苄和无水k2co3的反应摩尔比为1:1～3:1～2.5。
9、其中，步骤(1)所述有机溶剂为无水n,n-二甲基甲酰胺，反应温度为0～35℃。
10、其中，步骤(1)具体为，将化合物ii、4-甲氧基溴苄和无水k2co3有机溶剂中，在氩气保护下搅拌进行反应20～26h，待反应完毕后，将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取3～5次，合并有机层并用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压去除有机溶剂，即可得到中间体iii粗品，再将所得粗品经制备液相分离纯化后可得到纯品化合物iii，形状为白色粉末状固体。
11、其中，步骤(2)所述化合物iii和d-半胱氨酸盐酸盐的反应摩尔比为1:1～3，优选1:1。
12、其中，步骤(2)所述溶剂为甲醇与水的混合溶液，甲醇与水的体积比为2～4:1，优选2:1。
13、其中，步骤(2)具体为，将化合物iii、d-半胱氨酸盐酸盐先溶于溶剂中，再加入无水k2co3调节反应液的ph值为6～8，优选7.4，室温下搅拌3～4h，待反应完毕后，将上述反应液倒入水中，所得水溶液用二氯甲烷萃取，合并有机层并用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液。所得滤液经减压去除有机溶剂，即得到粗品探针pj-luc，最后，将所得到的粗品经制备液相分离纯化后得到高纯度生物发光探针pj-luc，性状为淡黄色粉末状固体。
14、上述生物发光探针在检测cyp 2j2活性及含量的试剂或试剂盒中的应用。
15、其中，所述的生物发光探针作为肿瘤特异性显像试剂，在肿瘤病灶组织高对比度、高准确度的成像中的应用。
16、专利技术原理：生物发光(bioluminescence，bl)作为一种有别于荧光成像的光学显像手段，其无需外部激发光源便可产生强烈的光学信号。因此，bl可以有效避免目前荧光探针在活体成像时的副作用，在成像准确性和生物安全性上有着显著的优势。由于cyp 2j2酶的活性中心位置存在一个狭长的空腔结构，因此对探针分子的整体空间体积和构型具有严格要求，本专利技术通过结构优化得到具有更高灵敏度、选择性和对比度的cyp 2j2响应型生物发光探针pj-luc，该探针由三部分组成：(1)d-荧光素(d-luciferin,d-luc)生物发光母核，该结构具有较好的生物安全性和量子产率；(2)甲氧基片段，该片段可特异性响应cyp 2j2，进而发生o-去甲基化反应；(3)对羟基苄醇自断裂片段，该片段被激活后可迅速释放出d-荧光素(d-luc)。
17、生物发光探针pj-luc的发光机制如下所示，pj-luc本身由于淬灭作用无任何光学信号，当其在cyp 2j2特异性催化作用下可选择性脱去分子结构中的甲基，生成化合物iv。化合物iv极不稳定，经分子内电子转移可自发脱除对羟基苄醇片段并释放出d-luc(v)，生成的d-luc在荧光素酶(firefly luciferase,fluc)的作用下迅速生成化合物vii并伴随有强烈的光学信号产生。
18、
19、有益效果：本专利技术和现有技术相比，具有如下优点：(1)本专利技术的生物发光探针pj-luc可用于实时、高灵敏度、高选择性、高对比度的精准追踪cyp 2j2活性及含量波动的检测；(2)本专利技术的生物发光探针pj-luc无需外界光源激发便可产生强烈的光学信号，因此其不会产生因激发光源导致的生物组织自发光、光漂白以及光散射等现象，在成像灵敏度和检测结果准确性上具有突出的优势，且无需外部激光激发，因此可有效避免光毒性以及激光导致的组织灼伤等副作用，在成像时具有显著的生物安全性；(3)生物发光探针pj-luc合成步骤简单，仅通过两步反应就能得到目标探针，制备过程简单，易于推广。
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1.一种检测细胞色素P450环氧合酶2J2的生物发光探针，其特征在于，所述探针化学结构式如式(I)：
2.一种权利要求1所述的生物发光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述化合物II、4-甲氧基溴苄和无水K2CO3的反应摩尔比为1:1～3:1～2.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂为无水N,N-二甲基甲酰胺，反应温度为0～35℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体为，将化合物II、4-甲氧基溴苄和无水K2CO3有机溶剂中，在氩气保护下搅拌进行反应20～26h，待反应完毕后，将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取3～5次，合并有机层并用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压去除有机溶剂，即可得到中间体III粗品，再将所得粗品经制备液相分离纯化后可得到纯品化合物III，形状为白色粉末状固体。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述化合物III和D-半胱氨酸
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述溶剂为甲醇与水的混合溶液，甲醇与水的体积比为2～4:1。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体为，将化合物III、D-半胱氨酸盐酸盐先溶于溶剂中，再加入无水K2CO3调节反应液的pH值为6～8，室温下搅拌3～4h，待反应完毕后，将上述反应液倒入水中，所得水溶液用二氯甲烷萃取，合并有机层并用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，所得滤液经减压去除有机溶剂，即得到粗品探针PJ-Luc，最后，将所得到的粗品经制备液相分离纯化后得到高纯度生物发光探针PJ-Luc，性状为淡黄色粉末状固体。
9.一种权利要求1所述生物发光探针在检测CYP 2J2活性及含量的试剂或试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的生物发光探针作为肿瘤特异性显像试剂，在肿瘤病灶组织高对比度、高准确度的成像中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测细胞色素p450环氧合酶2j2的生物发光探针，其特征在于，所述探针化学结构式如式(i)：
2.一种权利要求1所述的生物发光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述化合物ii、4-甲氧基溴苄和无水k2co3的反应摩尔比为1:1～3:1～2.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂为无水n,n-二甲基甲酰胺，反应温度为0～35℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体为，将化合物ii、4-甲氧基溴苄和无水k2co3有机溶剂中，在氩气保护下搅拌进行反应20～26h，待反应完毕后，将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取3～5次，合并有机层并用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压去除有机溶剂，即可得到中间体iii粗品，再将所得粗品经制备液相分离纯化后可得到纯品化合物iii，形状为白色粉末状固体。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：施翔，江翠翠，王睿，王仲崑，孙喜凤，耿婷婷，胡亮，张苗苗，金雨阳，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：
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