【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种磷脂dha的制备方法。
技术介绍
1、磷脂dha，是指在构成磷脂的脂肪酸中含有dha，又称dha型磷脂。甘油磷脂由甘油、脂肪酸、磷酸和极性头基组成。甘油磷脂是细胞膜和亚细胞膜的结构和功能成分，主要负责维持细胞屏障并作为脂质信号分子的前体。dha是n-3多不饱和脂肪酸(pufas)的一种，广泛存在于中枢神经系统，被认为是大脑灰质和眼睛视网膜中含量最丰富的pufa。
2、磷脂dha有利于人体对dha的吸收。乙酯型dha吸收率为20％左右，甘油三酯型dha吸收率略高，为50％左右；而卵磷脂型dha在体内以主动吸收的方式被吸收，吸收率接近100％。且可以迅速地为机体的大脑皮层供应所需的dha。除了维持大脑发育和健康，磷脂dha还可缓解lps介导的肠道屏障损伤、调节炎症介质的产生和免疫调节基因的表达、缓解癫痫发作、抑制净高脂血症等等。其不仅可以单独使用发挥其生物活性，还可以与虾青素、类胡萝卜素、类黄酮等物质结合使用，发挥更优异的特性，在食品、营养、保健、医药等领域有着广阔的应用前景。
3、目前磷脂dha绝大多数提取于海洋生物，以南极磷虾、海鱼卵等为原料提取产品，例如cn109401831a公开了一种从南极磷虾中提取分离纯化获得磷脂dha的方法，受限于海洋原料来源稳定性、海洋过敏原以及重金属污染等因素。另一获取磷脂dha的途径是通过喂食蛋鸡富含dha的饲料进行体内富集，cn103815434a将dha营养精华素粉剂作为蛋鸡饲料，并将鸡蛋卵黄制作为富含蛋黄卵磷脂的蛋黄粉，这种富集
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于新型双亲离子液体的磷脂dha制备方法，包括以下步骤：
2、步骤一：双亲离子液体的制备，将表面活性剂溶于有机试剂；
3、步骤二：先加入磷酸缓冲液，然后将大豆卵磷脂、游离dha油脂加入反应体系中，利用固定化磷脂酶a1进行催化反应得到磷脂dha；
4、步骤三：分离处理：催化反应结束后，过滤回收固定化磷脂酶a1，取出反应液，真空浓缩除去有机试剂，再加入丙酮进行沉淀；
5、步骤四：收集丙酮沉淀后的上清液，真空浓缩除去丙酮回收游离dha和表面活性剂。回收获得的未反应物，再加入大豆卵磷脂，可进入步骤二循环反应。
6、进一步的，所述步骤一中表面活性剂为丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠(aot)、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)或吐温80；所述有机溶剂为异辛烷、异辛烷正己醇混合液或正己烷。
7、进一步的，异辛烷正己醇混合液为异辛烷与正己醇以体积比4：1混合。
8、进一步的，所述步骤二中磷脂酶a1为d380树脂吸附固定化树脂，固定化的过程为：按照2：1：1的比例加入d380碱性离子交换树脂：磷脂酶a1：20mmol/l(ph＝5.5)磷酸盐缓冲液，在30℃摇床中以180r/min的转速振荡8小时，然后在35℃进行干燥。
9、进一步的，所述步骤二中催化反应为将大豆卵磷脂溶于适当的表面活性剂溶剂中，其中，大豆卵磷脂与游离dha的质量比为1:4-12，酶量为总底物质量的15％—35％，初始缓冲液量为总底物质量的0％-7％，反应温度为40℃-65℃，反应时间为12h—28h，搅拌速度为200rpm。
10、进一步的，酶量为20％，反应温度40℃，反应时间24h，底物比为10.389，水量为4.332％，溶剂量为587.025％。
11、进一步的，所述步骤三中真空浓缩温度为55℃；所述沉淀步骤具体为7000rpm离心5min，重复清洗5次。
12、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
13、1.本专利技术建立了基于双亲性离子液体体系，以固定化磷脂酶a1为催化剂制备磷脂dha的工艺，相比于初始体系体系，在最优工艺下，dha掺入量从22.79％提高到63.71％。
14、2.与现有技术相比，本专利技术在双亲性离子液体体系下，以大豆卵磷脂和游离脂肪酸为底物进行催化，酶添加量可控制在20％甚至15％以下，在使用较少酶的条件下即可达到较好的催化效果，且该酶为固定化酶，还可以重复利用。
15、3.本专利技术建立的双亲离子液体体系对于催化反应具有显著的提高作用，作用机制可能是：双亲性的反应体系，可以增强底物磷脂和脂肪酸的接触，增加传质效果，同时，表面活性剂可以激活磷脂酶或脂肪酶的盖子结构域，使其活性增强、稳定性增强，这种方法对其他类似固定化酶催化体系也具有普适性。
16、4.反应过程中使用部分表面活性剂可溶于丙酮，脂肪酸和表面活性剂可同时回收，与分离出的固定化酶一起用于循环催化，可在取得50％左右的掺入量的同时提高底物利用率，大大降低成本，有利于规模化生产。
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1.一种磷脂DHA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中表面活性剂为丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵或吐温80；所述有机溶剂为异辛烷、异辛烷正己醇混合液或正己烷。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，异辛烷正己醇混合液为异辛烷与正己醇以体积比4：1混合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中磷脂酶A1为D380树脂吸附固定化树脂，固定化的过程为：按照2：1：1的比例加入D380碱性离子交换树脂：磷脂酶A1：20mmol/L(pH＝5.5)磷酸盐缓冲液，在30℃摇床中以180r/min的转速振荡8小时，然后在35℃进行干燥。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中催化反应为将大豆卵磷脂溶于适当的表面活性剂溶剂中，其中，大豆卵磷脂与游离DHA的质量比为1:4-12，酶量为总底物质量的15％—35％，初始缓冲液量为总底物质量的0％-7％，反应温度为40℃-65℃，反应时间为12h—28h，搅拌速度为200rpm
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，底物比为10.389，水量为4.332％，溶剂量为587.025％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中真空浓缩温度为55℃；所述沉淀步骤具体为7000rpm离心5min，重复清洗5次。
...【技术特征摘要】
1.一种磷脂dha的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中表面活性剂为丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵或吐温80；所述有机溶剂为异辛烷、异辛烷正己醇混合液或正己烷。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，异辛烷正己醇混合液为异辛烷与正己醇以体积比4：1混合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中磷脂酶a1为d380树脂吸附固定化树脂，固定化的过程为：按照2：1：1的比例加入d380碱性离子交换树脂：磷脂酶a1：20mmol/l(ph＝5.5)磷酸盐缓冲液，在30℃摇床中以180r/min的转速...
【专利技术属性】
技术研发人员：任路静，余晓琳，胡学超，高勤，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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