【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疾病诊断方法，尤其涉及一种用于诊断膜性肾病的生物标志物及其应用方法。具体涉及血浆和尿液中细胞外囊泡mir-4639和mir-210在膜性肾病中的表达及疾病监测和预后评估。
技术介绍
1、膜性肾病是病理定义的肾小球疾病，也称为膜性肾小球肾炎，以基底膜外侧形成免疫复合物造成肾小球毛细血管壁明显增厚为特异性病变。免疫复合物沉积和膜攻击复合物形成所引起的足细胞结构紊乱可介导尿液中大量蛋白质的丢失，是造成肾病综合征的重要原因。膜性肾病是终末期肾脏疾病(end-stage renal disease,esrd)的重要原因，且有40％-50％表现为肾病综合征的膜性肾病患者在10年内进展为esrd，因而早期诊断和疾病进展监测在预防膜性肾病进展为esrd方面起着关键作用。如今，肾病诊断的金标准仍是肾脏活检，然而由于活检操作的侵入性，容易引起一些并发症，不适用于频繁的临床监测。因此，探索用于膜性肾病的非侵入性诊断和疾病监测的生物学标志物尤为重要。
2、近年来研究发现，细胞外囊泡(extracellular vehicles,ev)可以包裹和携带非编码微小rna(mirnas)并稳定存在于循环系统，使得ev mirna具备了成为无创、可靠生物标志物的条件。近年来，利用血液或尿液ev mirna作为肾脏疾病生物标志物的研究已有报道，例如，血清ev hsa-mir-377可能是诊断糖尿病肾病的非侵入性生物标志物。血清ev mir-93-5p可作为生物标志物来辅助早期诊断慢性肾脏病。尿液ev mir-29和mir-200b已被证明
3、公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在加深对本专利技术总体
技术介绍
的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
1、本专利技术的第一个目的是提供一种用于诊断膜性肾病的生物标志物，探讨血浆和尿液中细胞外囊泡mir-4639和mir-210在膜性肾病中的表达及疾病监测和预后评估。
2、本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
3、一种用于诊断膜性肾病的生物标志物，包括血浆和尿液中细胞外囊泡mir-4639和mir-210。膜性肾病患者中70％～80％的患者表现为肾病综合征，约30％伴有镜下血尿，且肾静脉血栓发生率可高达40％～50％。膜性肾病作为esrd的重要原因之一，缺乏无创非侵入性的诊断方法。ev因其独特的膜结构使包裹在内的物质更稳定，故ev mirna常被作为各类疾病的非侵入性诊断生物标志物。本申请聚焦于ev mir-4639和mir-210作为膜性肾病生物标志物的联合诊断效能这一问题展开探究。在膜性肾病的相关领域中，实现无创非侵入性的诊断方法。
4、本专利技术的第二个目的是提供细胞外囊泡mir-4639和mir-210作为膜性肾病生物标志物的研究方法，以协助膜性肾病的诊断，评估其严重程度和疾病进展。
5、本专利技术的上述技术目的是由以下技术方案实现的：
6、作为优选的，通过检测mir-4639和mir-210的相对丰度来确定受试者是否患有膜性肾病；其中，相比于健康人群，在膜性肾病患者中mir-4639和mir-210的相对丰度显著改变，所述显著改变是指同健康人群相比，膜性肾病患者中mir-4639和mir-210的相对丰度具有统计学显著性差异，即p值＜0.05；所述统计学方法包括方差检验，t-检验，秩和检验。
7、具体的，纳入30例健康对照、30例膜性肾病患者作为研究对象。入组对象的临床特征见表1。纳入标准：(1)肾脏活检确认肾脏组织病理学损伤；(2)年龄＞18岁；(3)签署知情同意书。排除标准：(1)患有恶性肿瘤、狼疮或严重肝病；(2)怀孕或哺乳期患者；(3)接受过肾脏移植或透析治疗；(4)患有其他器官明显纤维化的患者，如肝脏、心脏、肺和广泛的皮肤疤痕；(5)患有急性或慢性感染的患者。对照组纳入30例无蛋白尿、高血压、糖尿病、恶性肿瘤、肾功能受损或急慢性炎性反应性疾病的健康受试者。肾小球滤过率采用“ckd-epi方程”评估。
8、作为优选的，使用peg化学沉淀法提取血浆和尿液细胞外囊泡。电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析仪观察细胞外囊泡的形态学特征；蛋白质印迹测定囊泡表面标志物的表达水平。
9、作为优选的，清晨从禁食的研究对象身上采集2ml血液样本和50ml尿液样本。血液样本在收集的2h内离心并分离上层血浆。血浆和尿液分别于与等体积的16％或24％ peg溶液混合，4℃孵育过夜后以10,000rpm离心1h，完全弃去上清液，将ev沉淀重悬于磷酸盐缓冲液(pbs)中。通过透射电子显微镜(tem)观察ev形态。采用纳米颗粒跟踪分析仪分析ev的大小和浓度。采用蛋白质印迹法分析ev表面标志物(alix、cd63和cd81)表达情况：ev样本中加入蛋白裂解液，提取蛋白质，然后进行sds-page凝胶电泳。
10、作为优选的，使用qrt-pcr来检测血浆及尿液中细胞外囊泡mir-4639和mir-210的表达水平。
11、具体的，采用trizol ls试剂提取ev rna，采用mirna茎环法特异性逆转录引物将mirna逆转录成cdna。采用abi 7500荧光定量pcr仪进行目的序列扩增和熔解曲线分析，mir-4639定量扩增引物序列为：f:5'ttg ctaagt agg ctg aga3'，r:5'ctc aac tgg tgtcgt g 3'。mir-210定量扩增引物序列为：f:5'tct gtg cgt gtg acagc 3'，r:5'tgg tgtcgt gga gtc g 3'。evs mir-16为内参，mir-16定量扩增引物序列为：f:5'agc agc acgtaa ata ttg 3'，r:5'aac tgg tgt cgt gga g 3'。采用δδct法计算mirna表达差异。
12、作为优选的，采用graphpad prism 9.0软件进行数据分析和统计。通过image j软件分析蛋白质印迹的灰度值。所有数据以平均数±标准差、百分比或中位数表示。数本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于诊断膜性肾病的生物标志物，其特征在于，包括血浆和尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡miR-4639和miR-210在诊断膜性肾病中的应用方法，通过检测miR-4639和miR-210的相对丰度来确定受试者是否患有膜性肾病；其中，相比于健康人群，在膜性肾病患者中miR-4639和miR-210的相对丰度显著改变，所述显著改变是指同健康人群相比，膜性肾病患者中miR-4639和miR-210的相对丰度具有统计学显著性差异，即P值＜0.05；所述统计学方法包括方差检验，t-检验，秩和检验。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，使用PEG化学沉淀法提取血浆和尿液细胞外囊泡。
4.根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于，清晨从禁食的研究对象身上采集2mL血液样本和50 mL尿液样本；血液样本在收集的2 h内离心并分离上层血浆；血浆和尿液分别与等体积的16%或24% PEG溶液混合，4℃孵育过夜后以10,000 rpm离心1h，完全弃去上清液，将EV沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中；得
5.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，使用qRT-PCR来检测血浆及尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210的表达水平。
6.根据权利要求2或5所述的应用方法，其特征在于，miR-4639定量扩增引物序列为：F:5' TTG CTA AGT AGG CTG AGA 3'，R: 5' CTC AAC TGG TGT CGT G 3'；MiR-210定量扩增引物序列为：F : 5' TCT GTG CGT GTG ACA GC 3'，R : 5' TGG TGT CGT GGA GTC G 3'。
7.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，采用Pearson相关系数计算miR-4639和miR-210表达量与肾小球滤过率或者尿蛋白定量之间的相关性。
8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，血浆中细胞外囊泡 miR-4639和miR-210水平与研究对象的肾小球滤过率分别呈显著负相关。
9.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210水平与研究对象的24小时尿蛋白定量分别呈显著正相关。
10.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，通过受试者工作特征曲线（ROC）评估生物标志物的诊断效能。
...【技术特征摘要】
1.一种用于诊断膜性肾病的生物标志物，其特征在于，包括血浆和尿液中细胞外囊泡mir-4639和mir-210。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡mir-4639和mir-210在诊断膜性肾病中的应用方法，通过检测mir-4639和mir-210的相对丰度来确定受试者是否患有膜性肾病；其中，相比于健康人群，在膜性肾病患者中mir-4639和mir-210的相对丰度显著改变，所述显著改变是指同健康人群相比，膜性肾病患者中mir-4639和mir-210的相对丰度具有统计学显著性差异，即p值＜0.05；所述统计学方法包括方差检验，t-检验，秩和检验。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，使用peg化学沉淀法提取血浆和尿液细胞外囊泡。
4.根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于，清晨从禁食的研究对象身上采集2ml血液样本和50 ml尿液样本；血液样本在收集的2 h内离心并分离上层血浆；血浆和尿液分别与等体积的16%或24% peg溶液混合，4℃孵育过夜后以10,000 rpm离心1h，完全弃去上清液，将ev沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中；得到血浆和尿液细胞外囊泡。
5.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，使用...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈依梦，薛冬，赵枢辰，李正胜，
申请(专利权)人：常州市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：
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