【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞工程化改造领域，具体涉及一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法及其应用。
技术介绍
1、前列腺癌(prostate cancer，pca)是全球第二常见的癌症，是男性最常见的生殖系肿瘤，同时也是男性癌症死亡相关的第二大常见原因。前列腺癌的发病率会随着年龄的增长而升高，而随着我国人口老龄化的进一步发展，我国前列腺癌的发病率也在逐步上升。早期前列腺癌的主要治疗方法多为根治性切除术，而一旦疾病进展至晚期，主要治疗手段则是雄激素剥脱疗法(adt)，但在adt治疗的2-3年内其常会进展为去势抵抗型前列腺癌(crpc)。尽管早期前列腺癌患者的预后尚可，但当其进展至去势抵抗性前列腺癌时，大部分患者的预后较差。
2、目前，基于自然杀伤细胞，简称nk细胞(natural killer cells，nk cells)的免疫疗法在癌症治疗中逐渐兴起，使癌症治疗策略得到了发展。nk细胞是一种特殊的免疫细胞，不同于t细胞的激活需要抗原的加工和呈递，nk细胞的激活则依赖于nk受体，由于其激活条件相对简单，因此nk细胞在癌症免疫治疗领域引发了极大的关注，目前基于nk细胞的癌症免疫治疗已成了免疫治疗创新的主要方向。但在前列腺癌中的研究较少，且治疗效果不佳。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种裂亡前列腺癌细胞来源的囊泡制备和工程化改造方法，及其联合dox(阿霉素-临床上前列腺癌晚期常用化疗药物)，能够更好地杀伤前列腺癌细胞，并且同时上调癌细胞mica表达，有助于nk细胞免疫
2、本专利技术涉及的名词解释如下：
3、pc3细胞：人前列腺该细胞系中的雄激素抵抗性前列腺癌细胞；
4、nk细胞：自然杀伤细胞；
5、dox：阿霉素-临床上前列腺癌晚期化疗药物(购于mce公司，hy-15142)；
6、mica：是主要的nk细胞激活受体nkg2d的配体，在肿瘤细胞表面表达，有助于nk细胞识别与激活抗肿瘤效应；
7、micamrna：体外转录的人源mica mrna；
8、ev：细胞胞外囊泡；
9、mcd-pc3细胞：本专利技术对pc3细胞诱导后得到的裂亡细胞；
10、mev：本专利技术制备的mcd-pc3细胞分泌的细胞囊泡；
11、mmev：本专利技术制备的包载了micamrna的mev。
12、本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
13、本专利技术提供的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，提取pc3细胞中的ev，记为mev；采用mev对micamrna进行包载，使mica mrna转入mev，得到包载mica mrna的mev，记为mmev；其中，包载效率为20～50％。
14、本专利技术利用mev包载mica mrna制备mmev，并将其传递至前列腺癌细胞中，从而在保留mev杀伤前列腺癌细胞作用的同时上调其mica的表达情况。
15、进一步的，提取裂亡pc3细胞的ev，包括如下步骤：
16、采用多西他赛对pc3细胞进行诱导处理，得到mcd-pc3细胞；对mcd-pc3细胞进行紫外照射处理后，收集培养上清，超滤获得所述mev。
17、在本专利技术中，采用上述提取手段得到的mev具有更加柔软的特性，不但更容易被细胞吸收，抑制前列腺细胞活性，同时还可对mica mrna进行包载，进而提高对前列腺癌细胞的治疗作用。
18、进一步的，多西他赛的浓度为2～10nmol/l。
19、进一步的，紫外照射处理中，功率为15～18w，波长为240～260nm，照射时间为2～10min。
20、进一步的，采用进行包载(具体实施时mev颗粒数为1^1011，mrna为100ug)，具体包括如下步骤：将mev和mica mrna在缓冲液中混合得到混合物；对混合物进行电穿孔；对电穿孔后的混合物中的mev进行温育，得到mmev。
21、进一步的，本专利技术采用的电穿孔，电压为1000kv，电穿孔时间为5ms。
22、进一步的，本专利技术采用的温育的温度为35～38℃。
23、本专利技术还提供一种基于本专利技术提供的工程化改造方法得到的裂亡前列腺癌细胞囊泡的应用方法，具体为，将所述50μg mev与15μm dox联用，共同处理pc3细胞，促进pc3细胞凋亡。
24、进一步的，本专利技术还提供工程化改造方法得到的裂亡前列腺癌细胞囊泡的另一种应用，具体为，将mmev与dox联用，包括50μg mmev与5～50μm dox联合处理pc3细胞，促进pc3细胞凋亡的同时，显著上调pc3细胞的mica表达量。
25、综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
26、(1)本专利技术提供的mcd-pc3细胞具有衰老特征，在遭受损伤刺激时不会快速死亡裂解，有利于mev提取；
27、(2)本专利技术提供的mev与正常pc3分泌的ev相比，mev更加柔软容易被pc3细胞吸收，并且mev可以明显抑制pc3细胞活性。
28、(3)经过本专利技术提供的工程化改造后的mmev，和dox联用，可以杀伤pc3细胞的同时显著上调mica，有助于增强nk疗法，提升雄激素抵抗型前列腺癌的治疗效果。
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1. 一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，提取裂亡PC3细胞中的EV，记为MEV；采用MEV对MICA mRNA进行包载，使MICA mRNA转入MEV，得到包载MICA mRNA的MEV，记为MMEV；其中，包载效率为20~50%。
2.根据权利要求1所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述提取裂亡PC3细胞中的EV，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述多西他赛的浓度为2~10nmol/L。
4.根据权利要求2所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述紫外照射处理中，功率为15~18w，波长为240~260nm，照射时间为2~10min。
5. 根据权利要求1所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述采用MEV对MICA mRNA进行包载，具体包括如下步骤：将MEV和MICA mRNA在缓冲液中混合得到混合物；对混合物进行电穿孔；对电穿孔后的混合物中的MEV进行温育，得到所述MMEV。
6.根据权利要求5所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述电穿孔，电压为1000Kv，电穿孔时间为5ms。
7.根据权利要求5所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述温育的温度为35~38℃。
8.根据前述的工程化改造方法得到的裂亡前列腺癌细胞囊泡的应用，其特征在于，将所述MEV用于处理PC3细胞，使PC3细胞凋亡、增殖抑制和迁移减慢。
9. 根据前述的工程化改造方法得到的裂亡前列腺癌细胞囊泡的应用，其特征在于，将所述50μg MEV与15μM Dox联用，共同处理PC3细胞，促进PC3细胞凋亡。
10. 根据权利要求9所述的工程化改造方法得到的裂亡前列腺癌细胞囊泡的应用，其特征在于，所述MMEV与Dox联用，包括50μg MMEV与5~50 μM Dox联合处理PC3细胞，促进PC3细胞凋亡和PC3细胞的MICA表达量上调。
...【技术特征摘要】
1. 一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，提取裂亡pc3细胞中的ev，记为mev；采用mev对mica mrna进行包载，使mica mrna转入mev，得到包载mica mrna的mev，记为mmev；其中，包载效率为20~50%。
2.根据权利要求1所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述提取裂亡pc3细胞中的ev，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述多西他赛的浓度为2~10nmol/l。
4.根据权利要求2所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述紫外照射处理中，功率为15~18w，波长为240~260nm，照射时间为2~10min。
5. 根据权利要求1所述的一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法，其特征在于，所述采用mev对mica mrna进行包载，具体包括如下步骤：将mev和mica mrna在缓冲液中混合得到混合物；对...
【专利技术属性】
技术研发人员：范敏，史剑，邹一鸣，吴晓彤，孙阳洋，沈宇炜，
申请(专利权)人：常州市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：
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