【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种供体构建体、用于修饰细胞基因组的组合物及修饰细胞基因组的方法。
技术介绍
1、基因敲入(gene knock-in)是指利用随机整合、转座子系统及同源重组等方式将外源功能基因或片段插入到基因组中，使其在细胞内持续发挥功能的技术。它是研究基因功能、实现基因稳定过表达的一种有效工具。早期的基因敲入主要通过随机整合或转座子系统整合到宿主基因组中，这种敲入方式随机性较强，很容易引起其它基因功能的丧失，同时插入的拷贝数和位置不固定，因此同一来源的细胞系中不同的细胞间表达差异比较明显，不利于控制基因的表达水平及功能研究。利用crispr-cas基因组编辑系统可以实现外源基因的精确定点敲入，使遗传背景更为简单，实验操作更加精准、高效。
2、然而，crispr-cas基因组编辑系统的递送仍然是治疗开发的瓶颈。目前，腺相关病毒(aav)载体是基因治疗递送的主要平台，但其免疫原性和/或细胞毒性使得其具有安全风险。并且，病毒载体价格昂贵，对生产、制造以及供应都有较高的要求，一定程度上限制了基因治疗的应用。
3、因此，寻找非病毒载体递送的高效基因敲入方法成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种供体构建体、用于修饰细胞基因组的组合物及修饰细胞基因组的方法，用于解决现有技术采用病毒载体递送存在价格昂贵，对生产、制造以及供应要求较高的问题。
2、本专利技术的第一方面提供了一种供体构建体，供体构建体包括至少一
3、供体模板包括供体dna单链模板和转录因子结合位点；
4、转录因子结合位点包含具有转录因子识别基序的dna单链序列以及与具有转录因子识别基序的dna单链序列形成双链的反向互补多核苷酸单链序列；
5、具有转录因子识别基序的dna单链序列与供体dna单链模板侧接，和/或与具有转录因子识别基序的dna单链序列形成双链的反向互补多核苷酸单链序列与供体dna单链模板侧接。
6、本专利技术供体构建体中的供体模板包括供体dna单链模板和转录因子结合位点，转录因子结合位点可与细胞内的转录因子结合，进而通过具有入核功能的转录因子将供体dna单链模板载入细胞核中，使得供体模板无需病毒载体递送即可进入细胞核，解决现有技术采用病毒载体递送存在价格昂贵，对生产、制造以及供应要求较高的问题。
7、进一步地，在一些实施方案中，侧接为核苷酸序列骨架的直接连接，例如共价键连接；在一些实施方案中，侧接为通过连接子所实现的连接。连接子可以为1个或2个核苷酸，或多核苷酸序列；核苷酸可以包括任何种类的多核苷酸，如dna和/或rna。
8、在一些实施方案中，供体dna单链模板为单链线性同源定向修复模板，单链线性同源定向修复模板包括同源臂和目的片段。
9、在一些实施方案中，同源臂被配置为使得目的片段能够通过同源定向修复(hdr)被整合至目标基因座中。在一些实施方案中，同源臂有2个，分别位于目的片段的5'端和3'端。在一些实施方案中，同源臂序列长度为≥10bp、≥20bp、≥30bp、≥40bp、≥50bp、≥60bp、≥70bp、≥80bp、≥90bp、≥100bp、≥150bp、≥200bp、≥250bp、≥300bp、≥400bp、≥500bp、≥1kb、≥2kb或≥3kb。在一些实施方案中，同源臂序列长度为≤20bp、≤30bp、≤40bp、≤50bp、≤60bp、≤70bp、≤80bp、≤90bp、≤100bp、≤150bp、≤200bp、≤250bp、≤300bp、≤400bp、≤500bp、≤1kb、≤2kb或≤3kb。在一些实施方案中，同源臂序列长度为10bp-3kb、10bp-2kb、10bp-1kb、10bp-500bp、20bp-2kb、20bp-1kb、20bp-500bp、30bp-1kb、50bp-1kb、100bp-1kb或200bp-1kb。
10、在一些实施方案中，目的片段序列长度为≥50bp、≥100bp、≥200bp、≥500bp、≥1kb、≥1.5kb、≥2kb、≥3kb、≥4kb、≥5kb、≥6kb、≥7kb、≥8kb、≥9kb、≥10kb、≥12kb、≥15kb、≥20kb或≥30kb。在一些实施方案中，目的片段序列长度为≤200bp、≤500bp、≤1kb、≤1.5kb、≤2kb、≤3kb、≤4kb、≤5kb、≤6kb、≤7kb、≤8kb、≤9kb、≤10kb、≤12kb、≤15kb、≤20kb或≤30kb。在一些实施方案中，目的片段序列长度为50bp-30kb、100bp-10kb、100bp-8kb、100bp-5kb、200bp-5kb、500bp-5kb、1kb-5kb或1kb-10kb。在一些实施方案中，目的片段的序列长度为≥200bp。
11、在一些实施方案中，转录因子结合位点的个数为一个或至少两个。在一些实施方案中，转录因子结合位点的个数为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个。在一些实施方案中，转录因子结合位点的个数为1个或2个。
12、在一些实施方案中，转录因子结合位点结合或识别一种或至少两种转录因子。
13、在一些实施方案中，转录因子结合位点位于和/或接近供体dna单链模板的5'末端，和/或转录因子结合位点位于和/或接近供体dna单链模板的3'末端。
14、在一些实施方案中，转录因子结合位点位于和/或接近供体dna单链模板的5'末端。
15、在一些实施方案中，转录因子结合位点位于或接近供体dna单链模板的3'末端。
16、在一些实施方案中，供体dna单链模板的5'末端和3'末端各有1个转录因子结合位点。进一步地，5'末端和3'末端的转录因子结合位点结合或识别相同或不同的转录因子。
17、在一些实施方案中，具有转录因子识别基序的dna单链序列和与具有转录因子识别基序的dna单链序列形成双链的反向互补多核苷酸单链序列杂交，杂交为完全互补或不完全互补。
18、在一些实施方案中，具有转录因子识别基序的dna单链序列和与具有转录因子识别基序的dna单链序列形成双链的反向互补多核苷酸单链序列杂交，杂交为不完全互补，杂交的数量为一个或至少两个。
19、在一些实施方案中，具有转录因子识别基序的dna单链序列和与具有转录因子识别基序的dna单链序列形成双链的反向互补多核苷酸单链序列形成一个或至少两个发夹。
20、在一些实施方案中，供体模板包含供体dna单链模板，位于和/或靠近供体dna单链模板3'末端的第一具有转录因子识别基序的dna单链序列，以及位于和/或靠近供体dna单链模板5'末端的第二具有转录因子识别基序的dna单链序列，第一具有转录因子识别基序的dna单链序列和第二具有转录因子识别基序的dna单链序列互补。
21、更进一步的，供体模板如图1(a)、图1(b)、图1(c)、图1(d)、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种供体构建体，其特征在于，所述供体构建体包括至少一种供体模板；
2.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述供体DNA单链模板为单链线性同源定向修复模板；
3.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点的个数为一个或至少两个。
4.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点可结合一种或至少两种转录因子。
5.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点位于和/或接近所述供体DNA单链模板的5'末端，和/或所述转录因子结合位点位于和/或接近所述供体DNA单链模板的3'末端。
6.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点位于和/或接近所述供体DNA单链模板的5'末端。
7.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点位于或接近所述供体DNA单链模板的3'末端。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的供体构建体，其特征在于，所述具有转录因子识别基序的DNA单链序列和与所述具有转录因子
9.根据权利要求8所述的供体构建体，所述杂交为不完全互补，所述杂交的数量为一个或至少两个。
10.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述具有转录因子识别基序的DNA单链序列和与所述具有转录因子识别基序的DNA单链序列形成双链的反向互补多核苷酸单链序列形成一个或至少两个发夹。
11.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述供体模板包含所述供体DNA单链模板，位于和/或靠近所述供体DNA单链模板3'末端的第一具有转录因子识别基序的DNA单链序列，以及位于和/或靠近所述供体DNA单链模板5'末端的第二具有转录因子识别基序的DNA单链序列，所述第一具有转录因子识别基序的DNA单链序列和所述第二具有转录因子识别基序的DNA单链序列互补。
12.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点由转录因子识别，所述转录因子选自p53、ATF4、ATF3、ATF2、NR4A2、YAP、TAZ、AR、Nrf2、Nrf1、ATF6、C/EBP、CREB、EGR1、CBF(NF-Y)、ER、GATA、GR、HSF-1、MTF-1、Gli、HNF4、HIF-1a、IRF1、STAT1、STAT2、KLF4、LXR、SRF、Elk-1、AP-1、MEF2、c-Myc、Nanog、RBP-Jk、NF-κB、Oct4、Pax6、FOXO、NFAT、PPAR、PR、RAR、RXR、Sox2、STAT3、SMAD2、SMAD3、SMAD4、VDR、TCF7、TCF7L1、TCF7L2、LEF1和AhR中的任意一种或两种以上。
13.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点由转录因子识别，所述转录因子选自p53、ATF4、ATF3、ATF2和/或NR4A2中的一种或两种以上。
14.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述具有转录因子识别基序的DNA单链序列和/或与所述具有转录因子识别基序的DNA单链序列形成双链的反向互补多核苷酸单链序列选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示序列。
15.根据权利要求2所述的供体构建体，其特征在于，所述目的片段的序列长度为大于或等于200bp。
16.根据权利要求2所述的供体构建体，其特征在于，所述目的片段选自SEQ ID No.17或SEQ ID No.20所示序列。
17.一种用于修饰细胞基因组的组合物，其特征在于，包括权利要求1至16任意一项所述供体构建体。
18.根据权利要求17所述的用于修饰细胞基因组的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括：核酸酶和/或编码所述核酸酶的多核苷酸；
19.根据权利要求18所述的用于修饰细胞基因组的组合物，其特征在于，所述核酸酶为Cas蛋白；
20.根据权利要求19所述的用于修饰细胞基因组的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括：gRNA和/或编码所述gRNA的多核苷酸；
21.根据权利要求17所述的用于修饰细胞基因组的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括：Cas蛋白和/或编码所述Cas蛋白的多核苷酸，以及gRNA和/或编码所述gRNA的多核苷酸；
22.一种修饰细胞基因组的方法，其特征在于，包括：
23.根据权利要求22所述的修饰细胞基因组的方法，其特征在于，具体包括：
...【技术特征摘要】
1.一种供体构建体，其特征在于，所述供体构建体包括至少一种供体模板；
2.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述供体dna单链模板为单链线性同源定向修复模板；
3.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点的个数为一个或至少两个。
4.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点可结合一种或至少两种转录因子。
5.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点位于和/或接近所述供体dna单链模板的5'末端，和/或所述转录因子结合位点位于和/或接近所述供体dna单链模板的3'末端。
6.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点位于和/或接近所述供体dna单链模板的5'末端。
7.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点位于或接近所述供体dna单链模板的3'末端。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的供体构建体，其特征在于，所述具有转录因子识别基序的dna单链序列和与所述具有转录因子识别基序的dna单链序列形成双链的反向互补多核苷酸单链序列杂交；
9.根据权利要求8所述的供体构建体，所述杂交为不完全互补，所述杂交的数量为一个或至少两个。
10.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述具有转录因子识别基序的dna单链序列和与所述具有转录因子识别基序的dna单链序列形成双链的反向互补多核苷酸单链序列形成一个或至少两个发夹。
11.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述供体模板包含所述供体dna单链模板，位于和/或靠近所述供体dna单链模板3'末端的第一具有转录因子识别基序的dna单链序列，以及位于和/或靠近所述供体dna单链模板5'末端的第二具有转录因子识别基序的dna单链序列，所述第一具有转录因子识别基序的dna单链序列和所述第二具有转录因子识别基序的dna单链序列互补。
12.根据权利要求1所述的供体构建体，其特征在于，所述转录因子结合位点由转录因子识别，所述转录因子选自p53、atf4、atf3、atf2、nr4a2、yap、taz、ar、nrf2、nrf1、atf6、c/ebp、creb、egr1、cbf(nf-y)、er、gata、gr、hsf-1、mtf-1、gli、hnf4、hif-1a、irf1、stat1、stat2、klf4、lxr、srf、elk-1、ap-1、mef2、c-myc、nanog、rbp-jk、nf-κb、oc...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁峻彬，徐辉，梅志超，欧家裕，
申请(专利权)人：广州瑞风生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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