靶向USH2A基因pre-mRNA的gRNA、递送系统和CRISPR-Cas系统技术方案

本发明专利技术提供了靶向USH2A基因pre

【技术实现步骤摘要】
靶向USH2A基因pre
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mRNA的gRNA、递送系统和CRISPR
‑
Cas系统


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及靶向USH2A基因pre
‑
mRNA的gRNA、递送系统和CRISPR
‑
Cas系统。

技术介绍

[0002]Usher综合征(Usher Syndrome)是一类遗传性疾病，又称耳聋
‑
色素性视网膜炎综合征，其特征是不同程度的先天性感音神经性耳聋，以及色素性视网膜炎(RP)引起的进行性视力丧失。在临床上Usher综合征可分为3种类型：1、Ⅰ型Usher综合征，患者表现出先天性重深度感音神经性耳聋，前庭反应消失，青春期前出现色素性视网膜炎，逐渐致盲，其关联基因为MYO7A、CDH23、USH1C、PCHD15等；2、Ⅱ型Usher综合征，患者表现出先天性中重度感音神经性耳聋，前庭反应正常，青春期出现色素性视网膜炎，逐渐致盲，其关联基因为USH2A、GPR98、WHRN等；3、Ⅲ型Usher综合征，患者表现出进行性感音神经性耳聋，前庭反应正常，青春期末出现色素性视网膜炎，逐渐致盲，其关联基因为CLRN1等。
[0003]其中，II型占Usher综合症的比例超过50％。而USH2A基因突变是Usher综合征II型的最常见原因，涵盖超过50％的Usher综合征患者。同时，USH2A基因的突变也是导致非综合征性视网膜色素变性(NSRP)的重要原因之一。
[0004]USH2A定位于1q41，其在基因组中的跨度超过800kb，编码一个大型跨膜蛋白Usherin，其锚定在视网膜感光细胞和内耳毛细胞的质膜上，是纤毛发育和维持必不可少的组分。在视网膜中，Usherin是USH2复合物的重要部分，被认为在稳定光感受器的外节段发挥作用。USH2A具有2个亚型，在视网膜细胞中主要的亚型含有72个Exon，编码区长度约为15.6kb。Usherin蛋白的胞外部分包含许多重复的结构域，包括10个Laminin EGF
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like(LE)结构域和35个Fibronectin type 3(FN3)结构域。人USH2A外显子13长度为642bp，编码着第723～936位氨基酸，为Usherin蛋白中10个LE结构域中的4个。
[0005]USH2A基因的第13号外显子13、第50号外显子和第40号内含子的突变会引发Usher综合征。迄今为止已经鉴定出超过1000个分布在整个USH2A基因中的致病性突变，其中的外显子13是USH2A基因中突变最频繁的外显子，约占35％。USH2A编码区长度约为15.6kb，常规的基因治疗递送方法(如重组慢病毒、重组腺相关病毒等)难以包装如此庞大的编码序列，因此难以通过直接递送USH2A进行治疗。
[0006]现有技术中有通过反义寡核苷酸(AONs，Antisense oligonucleotides)靶向干扰pre
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mRNA剪接，促进外显子跳读。。反义寡核苷酸通常是大的亲水性多聚阴离子，这种特性意味着仅靠它们本身是不容易通过质膜的，因此将反义寡核苷酸疗法有效并特异地递送至靶器官是主要挑战。同时AONs容易降解，需要多次给药以维持效果。需要注意的是，AON给药后，会诱导外显子12和13的双跳，然而，外显子12的核苷酸数量并非3的整数倍，则外显子12和13双跳之后，会造成移码突变，仍然产生无效蛋白。
[0007]现有技术中还有通过使用单碱基编辑器修改上述剪接相关位点的关键碱基，亦可促进外显子跳读。但是现有的单碱基编辑器无法通过单个AAV载体装载，并且受PAM、编辑窗
口以及碱基转换类型的限制，可能在剪接相关位点附近没有合适的gRNA，且编辑效率较低。
[0008]而CRISPR
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Cas系统是由单个效应蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等)来发挥功能。其中，Cas13具有独特的核酸酶活性，可特异性地靶向切割RNA。通过活性位点突变可产生无核酸酶活性但可与靶RNA特异性结合的dCas13(dead Cas13)。现有技术通过dCas13组合碱基编辑蛋白如腺苷脱氨酶、胞苷脱氨酶的催化结构域，修正pre
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mRNA中的致病性突变；或通过与RNA的结合可能在空间上抑制剪接体与转录本的相互作用。
[0009]现有技术通过通过AAV搭配组织特异性启动子递送CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas12系统进行基因组DNA的编辑，利用Cas9或Cas12在DNA上产生双链断裂(DSB，Double strand break)，随后细胞进行非同源末端结合修复(Non
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homologous end joining，NHEJ)进而破坏RNA剪接相关的位点，如分支位点、剪接受体或剪接供体。CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12受限于PAM，可能在剪接相关位点附近没有合适的gRNA。另外，NHEJ修复的结果是难以预测的，可能导致较低的编辑效果。使用2个gRNA同时在USH2A内含子12和内含子13处造成DSB，可以直接删除外显子13。然而，使用片段删除的办法可能导致其他问题，例如染色体重排、AAV整合，并且两个gRNA导致的脱靶效果不能忽略。且以基因组为背景的Cas9/Cas12介导基因编辑，其脱靶可能会导致无法预估的风险。

技术实现思路

[0010]针对上述问题，本专利技术提供了一种靶向USH2A基因pre
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mRNA(核糖体前体：DNA转录产生的原始转录产物)的gRNA，该gRNA的靶向结构域与USH2A基因pre
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mRNA序列互补，所述gRNA通过与USH2A基因pre
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mRNA结合而使外显子13被剪接跳跃。
[0011]本专利技术人对USH2A进行了调查研究，发现小鼠USH2A的外显子12与人USH2A外显子13同源，长度均为642bp，移除该外显子并没有造成后续的移码突变。有研究显示，在敲除了小鼠USH2A的外显子12后，Usherin依然能够正确定位并且行使正常的功能。因此，对于包含致病性突变的人USH2A外显子13，可以利用一系列手段使其发生跳读进行治疗。
[0012]本专利技术提供一种靶向USH2A基因pre
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mRNA的gRNA，该gRNA的靶向结构域与USH2A基因pre
‑
mRNA序列互补，所述gRNA通过与USH2A基因pre
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mRNA结合而使外显子13被剪接跳跃。所述外显子13包括但不限于：野生型的外显子13、含有突变的外显子13。
[0013]本专利技术采用CRISPR
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Cas系统进行基因编辑，通过构建gRNA以引导CRISPR
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Cas系统靶向USH2A的Pre
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RNA外显子13，诱导外显子13剪接跳跃，从而治疗USH2A外显子13的错义、移码、终止密码本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向USH2A基因pre
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mRNA的gRNA，其特征在于，该gRNA的靶向结构域与USH2A基因pre
‑
mRNA序列互补，所述gRNA通过与USH2A基因pre
‑
mRNA结合而使外显子13被剪接跳跃。2.根据权利要求1所述的gRNA，其特征在于，所述USH2A基因pre
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mRNA序列选自以下区域：USH2A第13号外显子、第12号内含子或第13号内含子。3.根据权利要求2所述的gRNA，其特征在于，所述USH2A基因pre
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mRNA序列选自以下区域及相似性≥90％的序列：第12号内含子的剪接沉默子ISS、第13号外显子的分支位点BP、第13号外显子的剪接受体SA、第13号外显子的剪接供体SD、第13号外显子的剪接增强子ESE、第13号外显子的特异筛选位点EX、第13号内含子的剪接增强子ISE、第13号内含子的聚嘧啶束。4.根据权利要求3所述的gRNA，其特征在于，所述USH2A基因pre
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mRNA序列选自以下序列：SEQ ID NO：1
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38及相似性≥90％的序列。5.根据权利要求4所述的gRNA，其特征在于，所述USH2A基因pre
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mRNA序列选自SEQ ID NO：1
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13、SEQ ID NO：15
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20、SEQ ID NO：22
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38及相似性≥90％的序列。6.根据权利要求5所述的gRNA，其特征在于，所述USH2A基因pre
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mRNA序列选自SEQ ID NO：2、5、11、13、17、19、33及相似性≥90％的序列。7.一种靶向USH2A的CRISPR
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Cas系统，其特征在于，包括权利要求1
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6中任意一项所述的gRNA和dCas13核酸酶，或包括权利要求1
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6中任意一项所述的gRNA和dCas13核酸酶的核苷酸序列的核酸分子或载体。8.根据权利要求7所述的CRISPR
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Cas系统，其特征在于，所述CRISPR
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Cas系统还包括效应子结构域，所述效应子结构域包括以下功能元件的至少一种：hnRNPA1元件、SRSF1的RS富含结构域、RBM4的丙氨酸富含基序、DAZAP1的脯氨酸富含基序。9.根据权利要求8所述的CRISPR
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Cas系统，其特征在于，所述效应子结构域包括hnRNPA1元件。10.根据权利要求9所述的CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，所述hn...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁峻彬，欧家裕，徐辉，
申请(专利权)人：广州瑞风生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：