【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于移植排斥治疗领域，具体涉及一种靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞的构建方法及其应用。
技术介绍
1、器官移植是终末期器官衰竭患者的最佳治疗选择。尽管取得了部分成功，器官移植仍然面临许多困难，例如供体器官的来源有限、免疫抑制药物的副作用和免疫排斥反应。最理想的要求是需要供体和患者的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，hla)完全匹配(零错配)，但由于hla具有多态性，达到供受者hla零错配是非常困难的。为了防止患者针对不匹配的hla产生体液免疫排斥反应，当前治疗移植排斥反应的措施是终身服用免疫抑制剂，和用抗cd20单克隆抗体清除所有的b淋巴细胞，但此类方法会引起许多副作用，例如心血管并发症，慢性感染和发生恶性肿瘤的风险。
2、allo-反应性b细胞(allo-b细胞)是人体针对同种异体抗原发生免疫反应的一类b细胞，其产生的抗体称为抗同种异型抗体，如抗hla-ⅰ类和ⅱ类抗体。移植前预存的针对错配供体hla的抗体可介导超急性体液排斥反应。因此控制或清除allo-反应性b细胞可减少抗hla抗体的产生，减轻或消除体液排斥反应。控制或清除allo-反应性b细胞是诱导移植免疫耐受的一种新型和精准的手段。
3、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t，car-t)是指通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及t细胞激活信号的遗传物质转入t细胞，使t细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活，直接杀伤肿瘤细胞。car由包含单链可
4、目前临床上用于治疗和预防移植排斥反应的措施主要有应用利妥昔单抗(抗cd20)，血浆置换和蛋白a免疫吸附。用于预防由hla错配引起的器官移植排斥反应使用的抗cd20单克隆抗体清除所有的b淋巴细胞，特异性较低。使用血浆置换或蛋白a免疫吸附清除了所有的igg，可能造成患者免疫力低下，易发生感染。
5、综上，将car-t应用于消除致病性自身反应性b淋巴细胞可为预防体液免疫排斥反应提供一种新的策略。本专利技术的方法是特异性清除产生抗hla抗体的b淋巴细胞，具有显著的精准医疗特性。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于提供一种靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞的构建方法；通过car中的hla-ⅰ类分子与allo-b淋巴细胞表面特异性bcr结合从而靶向杀伤产生hla抗体的allo-b淋巴细胞，为器官移植后产生的急性排斥反应的免疫治疗提供新策略。
2、本专利技术的另一目的在于提供上述靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞的应用，具体为靶向杀伤allo-b淋巴细胞。
3、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
4、一种靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞，car结构依次为cd8信号肽、hla-ⅰ类分子、cd8铰链区、cd8跨膜结构域、4-1bb共刺激分子和免疫受体酪氨酸活化基序cd3 zeta。
5、进一步的，所述hla-ⅰ类分子序列包括α1、α2、α3和β2m片段。
6、进一步的，所述hla-ⅰ类分子为特异性hla-a24*02分子、hla-b13*02分子。
7、所述car结构的氨基酸序列由依次排列的以下组分组成：cd8信号肽氨基酸序列、hla-ⅰ类分子氨基酸序列、cd8铰链区氨基酸序列、cd8跨膜结构域氨基酸序列、4-1bb氨基酸序列、cd3 zeta氨基酸序列。
8、所述的cd8信号肽氨基酸序列，如seq id no.1所示；
9、所述的hla-ⅰ类分子氨基酸序列，如seq id no.2或seq id no.3所示；
10、所述的cd8铰链区氨基酸序列，如seq id no.4所示；
11、所述的cd8跨膜结构域氨基酸序列，如seq id no.5所示；
12、所述的4-1bb氨基酸序列，如seq id no.6所示；
13、所述的cd3 zeta氨基酸序列，如seq id no.7所示。
14、所述car结构的核苷酸序列由依次排列的以下组分组成：cd8信号肽核苷酸序列、hla-ⅰ类分子核苷酸序列、cd8铰链区核苷酸序列、cd8跨膜结构域核苷酸序列、4-1bb核苷酸序列、cd3 zeta核苷酸序列。
15、所述的cd8信号肽核苷酸序列，如seq id no.8所示；
16、所述的hla-ⅰ类分子核苷酸序列，如seq id no.9或seq id no.10所示；
17、所述的cd8铰链区核苷酸序列，如seq id no.11所示；
18、所述的cd8跨膜结构域核苷酸序列，如seq id no.12所示；
19、所述的4-1bb核苷酸序列，如seq id no.13所示；
20、所述的cd3 zeta核苷酸序列，如seq id no.14所示。
21、上述靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞的构建方法，包含步骤如下：
22、(1)hla-car重组质粒的构建：设计hla-ⅰ类分子序列为所述car结构的核苷酸序列，人工合成后通过分子克隆将重组序列插入到plvx-ef1α-ires-puro真核表达载体中；
23、(2)hla-car-t细胞的构建及表达：将hla-car重组质粒与慢病毒包装质粒共转染到293t细胞，收集慢病毒上清后转导人t淋巴瘤细胞，流式细胞术检测hla-car-t细胞表面hla抗原的表达水平。
24、步骤(2)中所述流式细胞术采用w6/32抗体，所述w6/32抗体由w6/32杂交瘤细胞产生，识别hla-ⅰ类分子。
25、上述靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞具有杀伤allo-b细胞的作用，可应用于靶向杀伤allo-b淋巴细胞。
26、其中，靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞具有杀伤allo-b细胞的作用，验证其杀伤allo-b细胞的实验包括如下：
27、验证靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞介导的杀伤作用：将hla-car-t细胞与产生抗hla-ⅰ类抗体的w6/32杂交瘤细胞共孵育，其中靶细胞(w6/32杂交瘤细胞)预先用cfse染色，加入hla-car-t细胞孵育后用7-aad染死细胞，通过流式检测并计算体外杀伤的靶细胞死亡率。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向清除allo-B淋巴细胞的CAR-T细胞，其特征在于：CAR结构包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的3个功能区域；所述胞外结构域包括CD8信号肽、HLA-Ⅰ类分子、CD8铰链区，所述跨膜结构域包括CD8跨膜结构域，所述胞内结构域包括4-1BB共刺激分子和免疫受体酪氨酸活化基序CD3zeta。
2.根据权利要求1所述的靶向清除allo-B淋巴细胞的CAR-T细胞，其特征在于：所述HLA-Ⅰ类分子结构包括α1、α2、α3和β2m片段；所述HLA-Ⅰ类分子能特异性结合抗HLA-Ⅰ类分子抗体。
3.根据权利要求1所述的靶向清除allo-B淋巴细胞的CAR-T细胞，其特征在于：所述的CD8信号肽氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示；
4.根据权利要求1所述的靶向清除allo-B淋巴细胞的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR结构的核苷酸序列由依次排列的以下组分组成：CD8信号肽核苷酸序列、HLA-Ⅰ类分子核苷酸序列、CD8铰链区核苷酸序列、CD8跨膜结构域核苷酸序列、4-1BB核苷酸序列、CD3 zeta核苷酸序列。
5.
6.权利要求1-5任一项所述的靶向清除allo-B淋巴细胞的CAR-T细胞的构建方法，其特征在于：包含步骤如下：
7.根据权利要求6所述的靶向清除allo-B淋巴细胞的CAR-T细胞的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所述流式细胞术采用W6/32抗体，所述W6/32抗体由W6/32杂交瘤细胞产生，识别HLA-Ⅰ类分子。
8.权利要求1-5任一项所述的靶向清除allo-B淋巴细胞的CAR-T细胞在制备靶向杀伤Allo-B淋巴细胞的药物中应用。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞，其特征在于：car结构包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的3个功能区域；所述胞外结构域包括cd8信号肽、hla-ⅰ类分子、cd8铰链区，所述跨膜结构域包括cd8跨膜结构域，所述胞内结构域包括4-1bb共刺激分子和免疫受体酪氨酸活化基序cd3zeta。
2.根据权利要求1所述的靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞，其特征在于：所述hla-ⅰ类分子结构包括α1、α2、α3和β2m片段；所述hla-ⅰ类分子能特异性结合抗hla-ⅰ类分子抗体。
3.根据权利要求1所述的靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞，其特征在于：所述的cd8信号肽氨基酸序列，如seq id no.1所示；
4.根据权利要求1所述的靶向清除allo-b淋巴细胞的car-t细胞，其特征在于：所述car结构的核苷酸序列由依次排列的...
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