【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生命医学工程领域，具体涉及一种用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条。
技术介绍
1、细菌的快速检测可以有效地保障人们的生命健康安全，减少抗生素的滥用。然而，当前细菌的检测方法主要依赖培养法、镜检法或pcr(polymerase chain reaction)法，上述方法不仅耗时同时还需要专业的操作人员和仪器。可视化检测细菌可以有效地减少检测细菌，避免大型仪器的使用，如大肠杆菌的侧向流试纸条。当前的细菌可视化检测方法依赖抗体和适配体作为识别标签。然而抗体和适配体的制备和开发需要大量的人力物力，并且每一批次的抗体还可能存在差异，不利于传感检测的稳定。同时，由于细菌的复杂和多样性，当前还有许多细菌未被开发出相应的抗体。因此，开发不依赖抗体或适配体的细菌广谱性检测方法具有重要的意义。
2、现有可以摆脱抗体或适配体的方法主要依赖pcr、表面增强拉曼等专业仪器。这些方法虽然能够摆脱抗体和适配体，但其仍无法摆脱对专业仪器设备的应用。近些年，人们提出传感阵列概念，旨在依靠各类细菌的特性，实现特异性的检测细菌。但当前此类方法多依靠紫外分光光度计等仪器输出信号，无法通过肉眼判断结果，同时也无法有效摆脱对专业仪器设备的依赖。因此，开发一种可以肉眼观察结果，不依赖专业仪器输出信号，同时可以摆脱抗体/适配体使用的广谱可视化检测方法，具有广泛的意义。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视
2、mtt(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)是一种常用于检测细胞活力和存活情况的化学品。其主要检测机理为：mtt进入到活细胞的线粒体中，琥珀酸脱氢酶能使外源的mtt还原为水不溶性的蓝紫色甲臢。经文献报导，mtt同样可以进入到细菌当中，产生蓝紫色甲臢信号，因此，mtt可作为信号源，用于广谱检测细菌的存在。然而，当前通过mtt作为信号检测细菌的工作，其可视化检测下限往往无法突破105cfu/ml，难以实现应用。考虑到mtt信号的产生依赖细菌的活性，因此，通过增强细菌的代谢来提高其信号强度具有可行性。本专利技术同步开发了相应的纸基器件，将样品中的细菌聚集在一条线上，有效提高了显色后结果的可观察程度，同时，还具有根据细菌代谢变化判别细菌种类的潜力。
3、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
4、本专利技术第一方面提供了一种用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，包括玻璃纤维膜、nc膜和吸水垫；所述玻璃纤维膜与nc膜一端重合0.5-1.5mm；所述吸水垫与nc膜的另一端重合0.5-1.5mm。
5、本专利技术采用的纸基器件由玻璃纤维膜、nc膜和吸水垫组成。以玻璃纤维膜作为样品垫滴添加样品，在吸水垫的作用力下，样品中的细菌流入到nc膜上，nc膜对细菌具有很强的亲和力，能够将细菌有效结合玻璃纤维膜与nc膜的交界处，有效富集了所有细菌。
6、优选地，所述玻璃纤维膜与nc膜一端重合1mm；所述吸水垫与nc膜的另一端重合1mm。
7、优选地，所述nc膜的宽度为2-6mm，长度为5-25mm。
8、在本专利技术的一些优选实施方式中，所述玻璃纤维膜尺寸为20mm×6mm，nc膜尺寸为5mm×6mm，吸水垫尺寸为50mm×6mm。
9、本专利技术第二方面提供了一种细菌广谱性检测方法，采用上述用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，包括以下步骤：将待测样品滴加到玻璃纤维膜上，将nc膜取出并置于mtt与营养物质的混合液中，放置25-35分钟完成显色；所述营养物质为三羧酸循环中的碳源物质，包括葡萄糖、琥珀酸和柠檬酸中的至少一种。
10、本专利技术采用添加营养物的方式来放大细菌还原mtt的效率。由于细菌还原mtt主要是通过琥珀酸脱氢酶实现的。考虑到琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环的重要组成部分，因此，引入三羧酸循环中的物质用于提高琥珀酸脱氢酶的反应效率，进而增加被还原mtt的数量，最终实现放大信号强度。本专利技术分别探究了在显色过程中加入葡萄糖、柠檬酸和琥珀酸三种物质对显色结果的影响。结果发现它们均可以有效提高信号的强度，并且呈现出在不同菌种有不同的提高效率。因此，可根据这一特性实现菌种的筛选。
11、优选地，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、弧菌中的至少一种。
12、优选地，所述混合液中mtt的浓度为0.5-5mg/ml；进一步优选地，所述混合液中mtt的浓度为0.5-3mg/ml。
13、优选地，所述混合液中营养物质的浓度为15-800mg/ml。
14、优选地，所述混合液的温度为25-37℃。
15、优选地，所述试纸条的检测限≤103cfu/ml。
16、本专利技术第三方面提供了一种测定抑制细菌的抗生素使用量的方法，采用上述用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，包括以下步骤：先通过试纸条测定待测样品中的细菌浓度，然后在待测样品中滴加抗生素，当待测样品的试纸条显色程度低于不含抗生素的样品时，说明该抗生素有效抑制细菌生长，得到抗生素的使用量。
17、本专利技术第四方面提供了一种测定灭杀细菌的消毒液使用量的方法，采用上述用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，包括以下步骤：先通过试纸条测定待测样品中的细菌浓度，然后在待测样品中滴加消毒液，当待测样品的试纸条不显色时，实现细菌杀灭，得到消毒液的使用量。
18、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
19、本专利技术通过纸基器件分离细菌，依靠nc膜对细菌的高亲和性，实现了免抗体/适配体等识别标签的应用，并有效富集了细菌，提高了一个数量级的细菌检测灵敏度。
20、本专利技术提出在mtt显色过程中加入营养液，细菌的显色信号得到了显著的提高，有效地提高mtt应用于细菌检测时的检测灵敏度(102cfu/ml)；同时，营养物的引入，使得本方法具有一定的特异性，实现了摆脱抗体/适配体以及仪器使用的广谱特异性检测。
21、本专利技术提出了通过添加营养液的方式提高mtt的信号，并且发现各种细菌对营养液的吸收效率各有异同，表现出其独特性。因此，结合pca(主成分分析)可有效的完本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，其特征在于，包括玻璃纤维膜、NC膜和吸水垫；所述玻璃纤维膜与NC膜一端重合0.5-1.5mm；所述吸水垫与NC膜的另一端重合0.5-1.5mm。
2.根据权利要求1所述的用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，其特征在于，所述NC膜的宽度为2-6mm，长度为5-25mm。
3.根据权利要求2所述的用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维膜尺寸为20mm×6mm，NC膜尺寸为5mm×6mm，吸水垫尺寸为50mm×6mm。
4.一种细菌广谱性检测方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，包括以下步骤：将待测样品滴加到玻璃纤维膜上，将NC膜取出并置于MTT与营养物质的混合液中，放置25-35分钟完成显色；所述营养物质为三羧酸循环中的碳源物质，包括葡萄糖、琥珀酸和柠檬酸中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的细菌广谱性检测方法，其特征在于，所述混合液中M
6.根据权利要求4所述的细菌广谱性检测方法，其特征在于，所述混合液中营养物质的浓度为15-800mg/mL。
7.根据权利要求4所述的细菌广谱性检测方法，其特征在于，所述混合液的温度为25-37℃。
8.根据权利要求4所述的细菌广谱性检测方法，其特征在于，所述试纸条的检测限≤103CFU/mL。
9.一种测定抑制细菌的抗生素使用量的方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，包括以下步骤：先通过试纸条测定待测样品中的细菌浓度，然后在待测样品中滴加抗生素，当待测样品的试纸条显色程度低于不含抗生素的样品时，说明该抗生素有效抑制细菌生长，得到抗生素的使用量。
10.一种测定灭杀细菌的消毒液使用量的方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，包括以下步骤：先通过试纸条测定待测样品中的细菌浓度，然后在待测样品中滴加消毒液，当待测样品的试纸条不显色时，实现细菌杀灭，得到消毒液的使用量。
...【技术特征摘要】
1.一种用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，其特征在于，包括玻璃纤维膜、nc膜和吸水垫；所述玻璃纤维膜与nc膜一端重合0.5-1.5mm；所述吸水垫与nc膜的另一端重合0.5-1.5mm。
2.根据权利要求1所述的用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，其特征在于，所述nc膜的宽度为2-6mm，长度为5-25mm。
3.根据权利要求2所述的用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维膜尺寸为20mm×6mm，nc膜尺寸为5mm×6mm，吸水垫尺寸为50mm×6mm。
4.一种细菌广谱性检测方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的用于致病菌广谱性检测及耐药性快速评价的免标记可视化试纸条，包括以下步骤：将待测样品滴加到玻璃纤维膜上，将nc膜取出并置于mtt与营养物质的混合液中，放置25-35分钟完成显色；所述营养物质为三羧酸循环中的碳源物质，包括葡萄糖、琥珀酸和柠檬酸中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的细菌广谱性检测方法，其特征在于，所述混合液中mtt的...
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