【技术实现步骤摘要】
本发属于生物医药，涉及一种响应致炎细胞因子的car序列和car-treg细胞的构建方法及应用。
技术介绍
1、调节性t细胞(regulatory t cells，tregs)是一类在维持免疫耐受性和抑制过度免疫反应中起关键作用的细胞，是机体内发挥免疫抑制功能的关键细胞亚群。近年来，通过引入嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)技术，研究者开始将car引导的treg细胞疗法应用于自身免疫疾病的治疗。
2、自身免疫病是一类发病机制复杂、疾病异质性高的疾病，涉及免疫系统对自身组织和细胞产生错误的攻击。目前传统的免疫抑制剂仍为临床首选疗法，治疗效果有限、副作用强，病人个体差异大是临床治疗的主要难点。
3、treg细胞在免疫系统中起到重要的调节作用，能够抑制过度免疫反应，使得炎症环境恢复稳态。tregs作为具有免疫抑制功能的重要细胞亚群之一，通过多种机制发挥其抑制作用，包括减弱效应t细胞的激活；与效应t细胞竞争结合il-2；抑制抗原呈递；分泌il-10、tgf-β、il-35等抗炎细胞因子；通过颗粒酶和穿孔素直接裂解靶细胞。treg细胞在维持外周耐受性方面发挥着主导作用，在许多自身免疫性疾病中都报道了tregs数量或功能缺陷。鉴于tregs在免疫调节中的重要作用，tregs的过继转移已被研究为恢复许多自身免疫性疾病耐受性的有希望的方法。然而，传统的多克隆treg疗法存在非特异性免疫抑制和细胞增殖受限制等问题，导致治疗效果不足和副作用较多。
4、相比于多克隆treg，抗
5、tnf-α作为多种炎症性疾病的治疗靶点，我们设计并制备了响应tnf-α的car-treg，并在移植物抗宿主排斥反应病(gvhd)和类风湿关节炎(ra)两种疾病的疾病模型中验证了其治疗的有效性。另一方面，专利技术人基于对自身免疫病复杂性的考虑，自身免疫病人体内往往同时存在多种致炎细胞因子，本申请进一步开发了可同时针对多种细胞因子的tancar-treg细胞，可发挥更为广泛的免疫抑制功能。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种可识别炎症环境中致炎细胞因子的car序列和car-treg细胞的构建方法及其在炎症性疾病中的应用，car-treg能捕获致炎性细胞因子，并将致炎因子的促炎性信号转变为treg细胞的生长和功能信号，进而发挥强效的免疫抑制效果。以致炎性细胞因子tnf-α为靶点，为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
2、本专利技术提供了一种识别致炎性细胞因子tnf-α，il-17a以及同时识别tnf-α和il-17a的car序列，所述car序列为ada-cd28-cd3ζ、ada-4-1bb-cd3ζ、ada-tnfr2-cd3ζ、ada-cd28-il2rβ-cd3ζ、tnfr2-cd28-cd3ζ、tnfr2-4-1bb-cd3ζ、tnfr2-tnfr2-cd3ζ、ada-tnfr2-il2rβ-cd3ζ、ixe-tnfr2-cd3ζ、ada-ixe-tnfr2-cd3ζ、ixe-ada-tnfr2-cd3ζ、ada-ixe2-tnfr2-cd3ζ、tnfr2-ixe-tnfr2-cd3ζ和ixe-tnfr2-tnfr2-cd3ζ中的任意一种；
3、其中ada-cd28-cd3ζ、ada-4-1bb-cd3ζ、ada-tnfr2-cd3ζ、ada-cd28-il2rβ-cd3ζ、tnfr2-cd28-cd3ζ、tnfr2-4-1bb-cd3ζ、tnfr2-tnfr2-cd3ζ和ada-tnfr2-il2rβ-cd3ζ为特异性响应人tnf-α的car序列；
4、所述ada-cd28-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.1所示；
5、所述ada-4-1bb-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.2所示；
6、所述ada-tnfr2-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.3所示；
7、所述ada-cd28-il2rβ-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.4所示；
8、所述tnfr2-cd28-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.5所示；
9、所述tnfr2-4-1bb-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.6所示；
10、所述tnfr2-tnfr2-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.7所示；
11、所述ada-tnfr2-il2rβ-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.8所示；
12、其中ixe-tnfr2-cd3ζ为特异性响应人il-17a的car序列；
13、所述ixe-tnfr2-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.9所示；
14、其中ada-ixe-tnfr2-cd3ζ、ixe-ada-tnfr2-cd3ζ、ada-ixe2-tnfr2-cd3ζ、tnfr2-ixe-tnfr2-cd3ζ和ixe-tnfr2-tnfr2-cd3ζ为特异性同时响应人tnf-α和il-17a的car序列；
15、所述ada-ixe-tnfr2-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.10所示；
16、所述ixe-ada-tnfr2-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.11所示；
17、所述ada-ixe2-tnfr2-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.12所示；
18、所述tnfr2-ixe-tnfr2-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.13所示；
19、所述ixe-tnfr2-tnfr2-cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.14所示。
20、本专利技术还提供了一种编码权利要求1中car序列的核苷酸序列，所述编码ada-cd28-c本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种识别炎症因子并可激活Treg细胞的CAR序列，其特征在于，所述CAR序列为Ada-CD28-CD3ζ、Ada-4-1BB-CD3ζ、Ada-TNFR2-CD3ζ、Ada-CD28-IL2Rβ-CD3ζ、TNFR2-CD28-CD3ζ、TNFR2-4-1BB-CD3ζ、TNFR2-TNFR2-CD3ζ、Ada-TNFR2-IL2Rβ-CD3ζ、Ixe-TNFR2-CD3ζ、Ada-Ixe-TNFR2-CD3ζ、Ixe-Ada-TNFR2-CD3ζ、Ada-Ixe2-TNFR2-CD3ζ、TNFR2-Ixe-TNFR2-CD3ζ和Ixe-TNFR2-TNFR2-CD3ζ中的任意一种；
2.一种编码权利要求1中CAR序列的核苷酸序列，其特征在于，所述编码Ada-CD28-CD3ζ的核酸序列如SEQ ID NO.15所示；
3.权利要求1或2所述CAR序列在构建CAR-Treg细胞中的应用。
4.一种CAR-Treg细胞，其特征在于，所述CAR-Treg细胞由CAR序列构建而成，所述CAR序列为权利要求1CAR序列中的任意一种。
5
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述同源重组的方法为：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中细胞接种的个数为5～6×106个，所述完全培养基为DMEM高糖培养基+9～11％FBS+双抗；所述过夜培养和继续培养的条件独立的为：35～39℃，4％～6％CO2；
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述外周血的用量为25～35mL，离心的转速为700～900g，离心的时间为8～12min，PBS缓冲液的用量为加入PBS后总体积为25～35mL；所述淋巴细胞的体积为18～22mL，再次离心的的转速为700～900g，离心的时间为18～22min，离心的温度为23～25℃；
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述清洗使用的清洗液为分选buffer，清洗的次数为1～3次，流式细胞仪分选的Treg亚细胞群的纯度为97～100％，所述Treg扩增培养基为：X-vivo 15培养基+9％～11％FBS+280～320U/mL IL-2+100nM雷帕霉素；所述Dynabeads为用抗CD3/抗CD28包被的Dynabeads，所述刺激培养的时间为44～52h；
10.权利要求9所述的CAR序列或权利要求4～9任意一项所述的CAR-Treg细胞在制备自身免疫病药物中的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病或炎性疾病包括移植物抗宿主病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫病性糖尿病、皮肌炎、硬皮病、多发性硬化、重症肌无力、脱髓鞘疾病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎缩性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症和/或自身免疫性脱发。
...【技术特征摘要】
1.一种识别炎症因子并可激活treg细胞的car序列，其特征在于，所述car序列为ada-cd28-cd3ζ、ada-4-1bb-cd3ζ、ada-tnfr2-cd3ζ、ada-cd28-il2rβ-cd3ζ、tnfr2-cd28-cd3ζ、tnfr2-4-1bb-cd3ζ、tnfr2-tnfr2-cd3ζ、ada-tnfr2-il2rβ-cd3ζ、ixe-tnfr2-cd3ζ、ada-ixe-tnfr2-cd3ζ、ixe-ada-tnfr2-cd3ζ、ada-ixe2-tnfr2-cd3ζ、tnfr2-ixe-tnfr2-cd3ζ和ixe-tnfr2-tnfr2-cd3ζ中的任意一种；
2.一种编码权利要求1中car序列的核苷酸序列，其特征在于，所述编码ada-cd28-cd3ζ的核酸序列如seq id no.15所示；
3.权利要求1或2所述car序列在构建car-treg细胞中的应用。
4.一种car-treg细胞，其特征在于，所述car-treg细胞由car序列构建而成，所述car序列为权利要求1car序列中的任意一种。
5.权利要求4所述car-treg细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述同源重组的方法为：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中细胞接种的个数为5～6×106个，所述完全培养基为dmem高糖培养基+9～11％fbs+双抗；所述过夜培养和...
【专利技术属性】
技术研发人员：张博，张烜，周德敏，孙也婷，王忞，纪德重，袁叶双，
申请(专利权)人：北京医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。