【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及剪接肽的鉴定方法。
技术介绍
1、免疫系统在识别自我和非自我并防御自我时需要复杂的过程。通过天然性免疫和获得性免疫这两种机制而触发免疫系统。天然性免疫主要具有快速识别并排除外源性异物的功能。作为弥补该天然性免疫的形态，而存在复杂的获得性免疫系统。
2、关于获得性免疫系统，当外源性异物侵入体内时或体内产生癌细胞等异物时，首先通过巨噬细胞等消化(分解)这些异物，已分解的异物被树突细胞识别并被树突细胞吞噬。需要说明的是，这些细胞也被称为抗原呈递细胞。
3、被树突细胞所吞噬的异物(蛋白质)被输送到细胞内，通过细胞质内的溶酶体、蛋白酶体等而被分解成肽。该肽以与存在于细胞内的主要组织相容性复合体(mhc：majorhistocompatibility complex)结合的状态被呈递至淋巴细胞(t细胞及b细胞)，该肽作为抗原而被淋巴细胞识别。人体内的mhc为人类白细胞型抗原(hla：human leukocyteantigen)。
4、淋巴细胞(t细胞及b细胞)的功能由细胞杀伤性免疫(t细胞)和体液免疫(b细胞)构成。成熟的t细胞具有瞄准所识别的抗原来集中攻击异物的能力。b细胞具有产生与所识别的抗原相结合的抗体而将异物(抗原)中和或使其失活的能力。
5、近年，为了提高癌症治疗方法(外科手术、化学疗法、放射线疗法等)的效果而日益关注癌免疫疗法。作为该癌免疫疗法的一例，已知接种癌特异性肽(正常细胞不具有而仅癌细胞所具有的肽)作为疫苗、通过获得性免疫功能来提高癌症治疗效果的方法(肽疫苗
6、hla具有由自父母分别继承一个而成的一对基因座决定的基因型(单倍型)，据说单倍型存在数万套。hla根据其多样化的单倍型而存在多样化的表型(hla型)。并且，已知被抗原呈递细胞呈递的作为抗原而与hla结合的肽(hla结合肽)根据hla型而不同。
7、因此，在接种某种肽疫苗后，关于该肽是否与hla结合并作为抗原被呈递至淋巴细胞、表现出获得性免疫功能，存在根据患者的hla型而各不相同的情况。因此可认为，在癌疫苗疗法中，理想的是根据患者的hla型适当选择用作疫苗的肽。
8、另外，以往认为蛋白质的剪接发生在对模板dna所转录出的mrna进行编辑时，但近年获知在蛋白酶体中分解异物蛋白质时发生使肽序列产生置换等的反应(肽剪接反应)(例如，参照专利文献1(欧州专利申请公开第2362225号说明书))。由于该肽剪接反应，抗原肽具有更大的多样性，这可能进一步提高了个体间的免疫反应的多样性。
9、考虑到这种多样化的剪接肽的存在、hla结合肽的多样性等，正在尝试研究准确地鉴定尽可能多的抗原肽。
10、现有技术文献
11、专利文献
12、专利文献1:欧州专利申请公开第2362225号说明书
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、例如研究了以下方法：合成包含抗原肽候补区域的蛋白质，对该蛋白质实际进行利用蛋白酶体的分解等，由此鉴定包含剪接肽的抗原肽。通过该方法能够可靠地得到抗原信息，能够确认剪接，但是存在通量低、难以进行高效鉴定的问题。
3、作为另一方法，已知有如下方法：利用质谱分析数据中大量出现的未鉴定ms/ms谱，实施对包括剪接肽等在内的未知的抗原肽进行鉴定的从头测序，对这里所鉴定出的肽的氨基酸序列，设定基于规定的鉴定评分(alc：average local confidence、by peaksstudio software)的截止值，作为抗原肽而得以鉴定。但是，数据处理复杂，存在难以进行高效鉴定的问题。另外，不能分离同质异位(isobaric)的氨基酸也成为原理上的瓶颈。
4、需要说明的是，成为新抗原候补的剪接肽序列的鉴定不能通过利用基因分析而得到的癌特异性变异信息、基于基因模板的序列预测、配对来进行。另一方面，通过质谱分析而鉴定出的抗原肽、通过从头测序而鉴定出的肽以及其剪接部位的鉴定信息、与和hla的亲和性相关的信息等也可在源数据库(氨基酸序列数据库)中进行累积并用作hla与抗原肽的亲和性预测、结构鉴定等的预测引擎。
5、本专利技术是为了解决上述的现有鉴定方法的问题而作出的，目的在于提供能够简便且高效地鉴定未知的剪接肽的方法。
6、用于解决问题的方案
7、本专利技术涉及对生物学样品中所含的源自已知母肽的未知剪接肽进行鉴定的方法，
8、(1)第1步骤，对上述样品实施质谱分析，由此得到上述样品中所含的肽的质谱分析数据；
9、(2)第2步骤，从作为已知氨基酸序列的数据库的初级文库中检索与上述质谱分析数据匹配的氨基酸序列，鉴定上述样品中所含的上述母肽；
10、(3)第3步骤，制作包含由所鉴定出的上述母肽可能产生的剪接肽的候补群的次级文库；和
11、(4)第4步骤，从上述次级文库检索与上述质谱分析数据匹配的氨基酸序列，鉴定上述样品中所含的上述剪接肽。
12、专利技术的效果
13、根据本专利技术，通过使用由利用初级文库鉴定出的特定母肽可能产生的剪接肽的候补群作为次级文库，能够简便且高效地鉴定未知的剪接肽。
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1.一种鉴定生物学样品中所含的源自已知母肽的未知剪接肽的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述候补群包含：由所述母肽产生的可能性高的剪接肽。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述候补群包含：通过对所述母肽进行C末端及N末端中的至少任意末端的规定数量以下的氨基酸残基的去除、以及规定数量以下的氨基酸残基向C末端及N末端的添加中的至少任意者而产生的变体肽。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述规定数量为2个残基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述质谱分析数据为质谱分析图谱，
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述母肽为已知的HLA结合肽。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述母肽为源自癌细胞的已知的肽。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述母肽为源自癌细胞的已知的HLA结合肽。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种鉴定生物学样品中所含的源自已知母肽的未知剪接肽的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述候补群包含：由所述母肽产生的可能性高的剪接肽。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述候补群包含：通过对所述母肽进行c末端及n末端中的至少任意末端的规定数量以下的氨基酸残基的去除、以及规定数量以下的氨基酸残基向c末端及n末端的添加中的至少任意者而产生的变体肽。
【专利技术属性】
技术研发人员：高口善信，岩本典子，岛田崇史，
申请(专利权)人：俄勒冈州普罗维登斯健康与服务部，
类型：发明
国别省市：
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