【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及前列腺癌ar基因检测，具体而言，涉及检测雄激素受体基因突变的核酸组合、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，虽然其在我国乃至亚洲地区的发病率较低，但随着我国人口老龄化及生活方式的变化，pca的发病率逐年增长，绝大多数男性患者会在2-5年的激素疗法调控后出现治疗耐药，最终发展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，crpc)。研究表明由激素敏感型前列腺癌进展成为crpc主要由拷贝数变异，雄激素受体基因ar异常(ar扩增和过表达、ar突变、组成活性ar变异的表达等)导致。人类ar基因由8个外显子组成，它们编码ar蛋白，包括n端结构域(ntd)、dna结合结构域(dbd)和配体结合结构域(lbd)。研究表明在15-20％的crpc中会发生ar基因的点突变，lbd中至少有5个主要点突变，即l702h、w742c、h875y、f877l和t878a。
2、其中，t878a/s、f877l、h875y是ar基因第8号外显子第878、877、875位密码子编码的氨基酸发生突变。t878a/s会对晚期前列腺癌临床用药阿比特龙、达洛鲁胺产生耐药性，f877l突变可以在crpc的体外和体内模型中赋予对恩扎鲁胺的抗性；h875y突变也可以在去势抵抗性前列腺癌患者中检出且同样对恩杂鲁胺、达洛鲁胺产生耐药；w742l/c是ar基因第5号外显子第742位密码子编码的氨基酸发生突变。多项研究显示，ar基因的w742l突变导致比卡鲁胺耐药，比卡鲁胺由
3、倘若能够在前列腺癌治疗过程中对ar基因进行监测，通过对ar基因扩增拷贝数和高频突变位点进行检测，就可以及时的了解患者病情进展，在疾病恶化之前更改治疗方案和靶向药物，从而提高前列腺癌的治愈率。因此检测ar基因突变状态是对前列腺癌分型诊断和预后有效治疗的重要前提。
4、目前常用的低频突变检测技术包括突变扩增系统arms(amplificationrefractory mutation system)、二代测序ngs(next generation sequencing)和数字聚合酶链式反应(digital polym erase chain reaction，dpcr)等，但这些技术不能兼具灵敏度高、成本低和周期短的优点。ngs技术灵敏度可达到1％，但是该技术存在操作复杂，花费高，需要测序设备，不适合临床大规模使用的问题；数字pcr技术灵敏度可达到0.01％，但是该技术也存在通量较低(一管最高10重反应)、需要特殊仪器设备、适用范围较为单一、检测成本较高的缺点。
5、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供检测雄激素受体基因突变的核酸组合、试剂盒及其应用以提高低频率基因变异的检测灵敏度和高特异性，提高检测效率，从而解决现有突变检测技术灵敏度低、成本高、周期长等问题。
2、本专利技术是这样实现的：
3、第一方面，本专利技术提供了检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其包括如下中的至少一种核酸组合：
4、用于检测ar基因第4号外显子l702h突变的第一核酸组合；用于检测ar基因第5号外显子w742c突变的第二核酸组合；用于检测ar基因第5号外显子w742l突变的第三核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子h875y突变的第四核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子f877l突变的第五核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子t878a突变的第六核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子t878s突变的第七核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子t878s突变和f877l突变的第八核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子t878a突变和f877l突变的第九核酸组合；
5、第一核酸组合包括依次如seq id no.1-2所示的检测引物、seq id no.3所示的探针和seq id no.4所示的阻滞序列；
6、第二核酸组合包括依次如seq id no.5-6所示的检测引物、seq id no.7所示的探针和seq id no.8所示的阻滞序列；
7、第三核酸组合包括依次如seq id no.5-6所示的检测引物、seq id no.9所示的探针和seq id no.8所示的阻滞序列；
8、第四核酸组合包括依次如seq id no.10-11所示的检测引物、seq id no.12所示的探针和seq id no.13所示的阻滞序列；
9、第五核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.16所示的探针和seq id no.17所示的阻滞序列；或如seq id no.14-15所示的检测引物、seq idno.16所示的探针和seq id no.18所示的阻滞序列；
10、第六核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.19所示的探针和seq id no.18所示的阻滞序列，或如seq id no.14-15所示的检测引物、seq idno.19的探针和seq id no.18所示的阻滞序列；
11、第七核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.20所示的探针和seq id no.17所示的阻滞序列；
12、第八核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.22所示的探针和seq id no.17所示的阻滞序列；或如seq id no.14-15所示的检测引物、seq idno.22所示的探针和seq id no.18所示的阻滞序列；
13、第九核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.21所示的探针和seq id no.17阻滞序列；或如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.21所示的探针和seq id no.18所示的阻滞序列。
14、术语“探针”是指对应于能够特异性结合dna的数个碱基至数百个碱基的核酸片段，例如rna或dna等。由于被标记，因而可以确认是否存在特定的dna。探针能够以寡核苷酸探针、单链dna探针等形式制造。
15、本专利技术针对低频突变基因检测将等位基因特异性扩增(arms-qpcr)技术与野生型阻滞序列(blocker)结合，构建了探针式实时荧光pcr方法，设计出针对ar基因5个突变位点的引物，探针和阻滞序列，以进一步提高低频率基因变异的检测灵敏度和高特异性。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，其包括如下中的至少一种核酸组合：
2.根据权利要求1所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，所述探针的5’端和/或3’端具有荧光基团或淬灭基团修饰；
3.根据权利要求2所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，所述荧光基团选自以下的一种：FITC、TET、JOE、R110、FAM、CY5、CY5.5、HEX、VIC、ROX、tex-Red和CY3；优选地，所述淬灭基团为MGB。
4.根据权利要求1所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，所述阻滞序列的3端带有如下修饰中的任一种：
5.根据权利要求4所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，所述第一核酸组合至第九核酸组合中，至少一种核酸组合中的阻滞序列中的至少一位核酸具有锁核酸修饰；
6.一种试剂盒或基因芯片，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合。
7.一种检测雄激素受体基因突变的方法，所述方法以非疾病的诊断为目的，其特征在于，其
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测样本选自组织来源的DNA、体液来源的细胞外囊泡DNA及cfDNA样本；
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增反应过程中，检测AR基因第4号外显子L702H突变时，退火温度为65℃±0.5℃；检测AR基因第5号外显子W742C突变时，退火温度为65℃±0.5℃；检测AR基因第5号外显子W742L突变时，退火温度为63.5℃±0.5℃；检测AR基因第8号外显子H875Y突变时，退火温度为65℃±0.5℃；检测AR基因第8号外显子F877L突变时，退火温度为60℃±0.5℃；检测AR基因第8号外显子T878A突变时，退火温度为62℃±0.5℃；检测AR基因第8号外显子T878S突变时，退火温度为62℃±0.5℃；检测AR基因第8号外显子T878S突变和F877L突变时，退火温度为60℃±0.5℃；检测AR基因第8号外显子T878A突变和F877L突变时，退火温度为60℃±0.5℃；
10.如权利要求1-5任一项所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合在制备雄激素受体基因突变检测、前列腺癌分型诊断、前列腺癌预后、疗效评估或复发监测产品中的应用；
...【技术特征摘要】
1.检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，其包括如下中的至少一种核酸组合：
2.根据权利要求1所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，所述探针的5’端和/或3’端具有荧光基团或淬灭基团修饰；
3.根据权利要求2所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，所述荧光基团选自以下的一种：fitc、tet、joe、r110、fam、cy5、cy5.5、hex、vic、rox、tex-red和cy3；优选地，所述淬灭基团为mgb。
4.根据权利要求1所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，所述阻滞序列的3端带有如下修饰中的任一种：
5.根据权利要求4所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其特征在于，所述第一核酸组合至第九核酸组合中，至少一种核酸组合中的阻滞序列中的至少一位核酸具有锁核酸修饰；
6.一种试剂盒或基因芯片，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合。
7.一种检测雄激素受体基因突变的方法，所述方法以非疾病的诊断为目的，其特征在于，其包括：采用权利要求1-5任一项所述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合或权利要求6所述的试剂盒或基因芯片对...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁汀，曾宪飞，郝晓柯，李晓，
申请(专利权)人：西安区域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。