【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及用于核酸质谱检测的直接扩增试剂、试剂盒及方法。
技术介绍
1、诸多研究表明，特定人群携带有某种与疾病相关的易感基因。当这些人群暴露于不利环境或不良因子时，其患相应疾病的概率相较于不携带易感基因的人群显著增加，可达数十至数千倍之多。随着社会经济的发展、国民生活方式的改变以及老龄化时代的到来，心脑血管疾病负担日趋沉重，严重威胁着人类的健康，主要包括高血压、心绞痛、心律失常、心力衰竭、心肌梗死等。因此，为有效预防心血管疾病，应进行相关易感基因的筛查，以便尽早发现潜在风险。
2、鉴于心脑血管易感基因检测涉及众多位点，荧光定量pcr法在实际应用中往往仅能覆盖3-5个位点，因而难以满足大规模位点的检测需求。虽然高通量测序技术具备多基因多位点检测的能力，但其成本较高、操作复杂且耗时较长。核酸质谱检测技术，可实现多种疾病多位点的准确检测，同时具备高准确性、强灵活性、高通量、检测周期短以及性价比优势，因此适用于心脑血管易感基因的检测。核酸质谱检测是将通过直接多重pcr反应(直接扩增)、sap反应及单碱基延伸反应得到目标位点特异性的延伸产物片段经过脱盐后，自动点样在芯片基质上，形成共结晶，制得的共结晶在质谱仪的真空管内经强激光激发，核酸分子解吸附为离子，带正电的单电荷离子在真空管中加速向高度灵敏的检测器飞去；电场中离子飞行时间与离子质量成正比，离子质量越小就越快到达检测器。因此可通过飞行时间差异，把不同质量的离子区分开。
3、然而，基于pcr技术的检验方法与检测手段在扩增前，需对生物样本的dna进
4、直接扩增技术又称直接pcr或免提取扩增技术，是一种无需提取样本直接加入pcr反应体系扩增产物的操作，与传统方法相比，直接扩增技术省略了样本提取步骤，节省成本及时间，并且也避免提取过程中造成的样本污染等问题。直接扩增技术中比较常见的样本类型有血液、唾液以及血卡载体(如fta卡、903卡及滤纸等)。其中，血卡是针对各种不同类型样本较好的收集、长期保存、运输的载体，一般可以常温保存5～10年，同时血卡纯化后的核酸样本可以用于后续的pcr、rt-pcr、酶切等分子操作。直接扩增目前常用于法医str检测，尚未与核酸质谱检测技术进行结合。
5、专利技术人团队尝试将直接扩增技术与核酸质谱检测相结合，以期进一步降低检测成本及检测时间，提高检测通量。然而，实验过程中发现，对血卡样本进行直接扩增时，由于血卡样本中含有大量的pcr抑制剂，往往会导致扩增效率降低或扩增失败。另一方面，现有技术中的直接扩增试剂(如中国专利cn 103305499 a、cn 112481360 a)一般是针对str荧光复合扩增进行设计的，此类试剂成分复杂，会严重影响样品延伸产物片段与核酸质谱芯片基质的共结晶状态，导致基质被带走或检测峰质量偏低，坏点率增加。因此，亟需探寻一种可用于核酸质谱检测的直接扩增试剂，该试剂既要耐受血液、血卡样本，实现对血液、血卡样本的多重扩增效果，保证扩增的效率，又要防止直接扩增试剂中的添加剂不影响核酸质谱上机检测时样品与芯片基质的共结晶效果。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中直接扩增试剂无法耐受血液、血卡样本，且成分复杂导致样品延伸产物片段与芯片基质的共结晶效果差、坏点率高的问题，本专利技术提供了一种用于核酸质谱检测的直接扩增试剂，以及含有该直接扩增试剂的用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的试剂盒及方法。该直接扩增试剂不仅可兼容血液和血卡样本，实现对这两种样本的多重扩增效果，确保扩增效率，且成分简单，不会对上机检测时样品与芯片基质的共结晶效果产生负面影响。本专利技术还将该直接扩增试剂应用于制备用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的试剂盒，仅需1ul全血样本或0.5mm血卡样本，单孔一次检测即可实现16个snp位点的同时检测，有效提高了检测效率及准确率，降低检测成本。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于核酸质谱检测的直接扩增试剂，包括非离子表面活性剂、醇类化合物、bsa、tris-hcl缓冲液。
3、作为优选，所述非离子表面活性剂为吐温20、吐温60、吐温80、tritonx-100中的至少一种，更优选为吐温20；所述醇类化合物为peg400、peg600、peg6000、peg8000、丙三醇中的至少一种，更优选为peg6000。专利技术人团队通过对不同成分交叉试验，并在直接扩增试剂中添加合适浓度的bsa、tris-hcl缓冲液等，筛选出较佳的添加剂，即所述的非离子表面活性剂及醇类化合物，配置得到的直接扩增试剂可以实现对血液样本、血卡样本的直接扩增，并具有很好的灵敏度、特异性，且不会对上机检测时样品与芯片基质的共结晶效果产生负面影响。
4、作为优选，所述非离子表面活性剂的终浓度为1％-1.5％(如1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％)，更优选为1％-1.2％。
5、作为优选，所述醇类化合物的终浓度为5％-5.5％(如5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％或5.5％)，更优选为5％-5.3％。
6、作为优选，所述bsa的终浓度为800～1000μg/ml(如800μg/ml、900μg/ml或1000μg/ml)，更优选为1000μg/ml。
7、作为优选，所述tris-hcl缓冲液的终浓度为1～1.2mmol/l(如1mmol/l、1.1mmol/l或1.2mmol/l)，更优选为1.2mmol/l。
8、本专利技术对直接扩增试剂中的各成分设计了不同的浓度梯度，配制成不同的直接扩增试剂，用于对样品进行直接扩增，经sap反应、延伸反应后使用核酸质谱仪自动点样模块将使用不同直接扩增试剂配方的样品点在芯片的基质点上，使样本与基质共结晶，查看基质点样前后的形态，最终确定了较优的直接扩增试剂，所述的直接扩增试剂由终浓度为1％-1.2％吐温20、1000μg/ml bsa、5％-5.5％peg6000、1.2mmol/ltris-hcl组成。
9、本专利技术还提供了所述的用于核酸质谱检测的直接扩增试剂的应用，为下列(1)-(4)中的至少一种：
10、(1)对样本进行dna分型检测；
11、(2)对样本进行直接扩增；
12、(3)制备用于对样本进行dna分型检测的试剂盒；
13、(4)制备用于对样本进行直接扩增的试剂盒。
14、本专利技术还提供了一种用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的试剂盒，包括所述的用于核酸质谱检测的直接扩增试剂、扩增引物、延伸引物。作为优选，所述扩增引物选自碱基序列如seq id n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于核酸质谱检测的直接扩增试剂，其特征在于，包括非离子表面活性剂、醇类化合物、BSA、Tris-HCl缓冲液。
2.如权利要求1所述的直接扩增试剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂为吐温20、吐温60、吐温80、TritonX-100中的至少一种。
3.如权利要求1所述的直接扩增试剂，其特征在于，所述醇类化合物为PEG400、PEG600、PEG6000、PEG8000、丙三醇中的至少一种。
4.如权利要求1所述的直接扩增试剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂的终浓度为1％-1.5％。
5.如权利要求1所述的直接扩增试剂，其特征在于，所述醇类化合物的终浓度为5％-5.5％。
6.如权利要求1-5任一所述的直接扩增试剂的应用，为下列(1)-(4)中的至少一种：
7.一种用于核酸质谱检测人多种心脑血管疾病易感基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5任一所述的直接扩增试剂、扩增引物、延伸引物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，
9.一种非诊断目的核酸质谱检测人多种心脑血
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述样本选自血液或血卡。
...【技术特征摘要】
1.一种用于核酸质谱检测的直接扩增试剂，其特征在于，包括非离子表面活性剂、醇类化合物、bsa、tris-hcl缓冲液。
2.如权利要求1所述的直接扩增试剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂为吐温20、吐温60、吐温80、tritonx-100中的至少一种。
3.如权利要求1所述的直接扩增试剂，其特征在于，所述醇类化合物为peg400、peg600、peg6000、peg8000、丙三醇中的至少一种。
4.如权利要求1所述的直接扩增试剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂的终浓度为1％-1.5％。
5.如权利要求1所述的直接扩增试剂，其特征在于，所述醇类化合物的终浓度为5％-5.5％。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：祖金珊，郭金海，吕全超，
申请(专利权)人：杭州聚致生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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