【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于苯并芘检测，具体涉及一种苯并芘免疫亲和柱及其制备方法和应用。
技术介绍
1、石油作为最重要能源资源和工业原料，为社会发展提供着最根本的保障。随着常规油气资源的萎缩、致密油的开发力度加大，钻井数量和深度都快速增长，产生巨量的钻井废弃物。钻井废弃物中的污染物会对环境产生危害，上述污染物中，苯并芘有"三致"效应，通常作为环境致癌物的代表被重点监测。已实施的db65/t3997—2017《油气田钻井固体废物综合利用污染控制要求》，首次将苯并芘列为钻井废弃物的污染控制指标，最高允许限值为0.7mg/k。
2、cn105548382a公开了一种土壤中苯并芘的检测方法，包括以下步骤：准确称取土壤样品于具塞锥形瓶中，加入8-10倍量的有机溶剂a，加塞后振摇，再超声提取至少30min，离心后收集上清液，残留土壤样品中再加入相当于土壤样品8-10倍量的有机溶剂a，超声提取至少30min，离心，合并上清液，取有机溶剂a加入固相萃取柱进行活化，活化完成后将合并的上清液转移到活化后的固相萃取柱中，用有机溶剂a洗脱。该检测方法的操作简便，步骤简单，有效减少了人为误操作导致吸入或皮肤接触到苯并芘的几率，提高了实验人员工作的安全性。
3、cn103472170a公开了一种食用油中苯并芘的检测方法，包括以下步骤：称取油样，加入氢氧化钾乙醇水溶液振荡至澄清后，于50℃的水浴中皂化1h，待冷却到室温，往样品离心管中加入水，摇匀后加入15ml正己烷，混匀，离心，用5ml超纯水洗涤2次，提取液置于氮吹仪中浓缩至干，用四氢呋喃+乙腈＝
4、由于苯并芘的致癌性，对于石油化学剂中苯并芘的检测和分离显得尤为重要，虽然现有技术已经公开了一些苯并芘类物质的检测方法，有高效液相色谱法(hplc)、液相色谱与质谱联用法(lc-ms)、气质联用法(gc-ms)等方法，由于苯并芘在油田化学剂中通常为微量甚至痕量级，且油田化学剂基体复杂，干扰物多，往往难以直接测定，所以若使用仪器测定则需要复杂的前处理；目前市场上存在的一些固相萃取柱产品，由于其回收率低、样品基质干扰仍较严重，并且需要大量的有机溶剂等因素，大大降低了方法的应用率，因此，开发一种回收效率高，灵敏度较好，并且可以有效降低石油化学剂基质中脂类、蛋白质、色素等成分的影响的检测方法，是本领域的研究重点。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种苯并芘免疫亲和柱及其制备方法和应用。本专利技术提供的苯并芘免疫亲和柱能够有效富集石油化学剂中的残留苯并芘，有效将苯并芘与干扰组分分离，提高苯并芘的回收率，提高检测的准确度。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种苯并芘免疫亲和柱，所述苯并芘免疫亲和柱的填充物包括偶联有苯并芘单克隆抗体的固相载体。
4、本专利技术提供的苯并芘免疫亲和柱中填充物是苯并芘单克隆抗体与固相载体的偶联产物，该填充物能够有效富集石油化学剂中的残留苯并芘，有效将苯并芘与干扰组分分离，提高苯并芘的回收率，提高检测的准确度。
5、优选地，所述苯并芘单克隆抗体由苯并芘半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
6、优选地，所述苯并芘半抗原的结构为本专利技术限定的苯并芘半抗原中包括氢化苯并芘衍生结构。
7、优选地，所述载体蛋白包括钥孔血蓝蛋白(klh)、鸡卵白蛋白(ova)或牛血清白蛋白(bsa)中的任意一种。
8、优选地，所述固相载体包括琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、硅橡胶中的任意一种。
9、优选地，所述苯并芘免疫亲和柱的填充物还包括保存液。
10、优选地，所述保存液包括pbs缓冲液、hepes缓冲液、三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液中的任意一种。
11、本专利技术苯并芘免疫亲和柱中的苯并芘单克隆抗体是由苯并芘半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，因此，该抗体可以特异性吸附石油化学剂中的苯并芘类物质，有效提高了苯并芘的回收率，同时可以减少石油化学剂中其他脂质、蛋白质、色素等杂质的干扰，提高了苯并芘检测的准确性。
12、优选地，所述苯并芘半抗原采用如下方法进行制备，所述方法包括：
13、将7,8,9,10-四氢苯并[a]芘-7-醇溶于溶剂中，加入琥珀酸酐和4-二甲基氨基吡啶(dmap)，加热回流，待反应完全，加入酸性ph调节剂调节ph至4，得到苯并芘半抗原。合成路线如下所示：
14、
15、优选地，所述苯并芘半抗原-载体蛋白偶联物采用如下方法进行制备，所述方法包括：
16、将所述苯并芘半抗原与活化剂混合，得到苯并芘半抗原活化液；所述苯并芘半抗原活化液与载体蛋白反应，得到所述苯并芘半抗原-载体蛋白偶联物。
17、优选地，所述活化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)的组合。
18、优选地，所述载体蛋白溶解于缓冲溶液中，所述缓冲溶液优选为碳酸盐缓冲溶液。
19、优选地，所述苯并芘单克隆抗体采用如下方法进行制备，所述方法包括：
20、将所述苯并芘半抗原-载体蛋白偶联物注入动物体内，发生免疫反应后，取动物的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；从融合后的细胞中筛选得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，之后经扩大培养、动物体内培养，得到所述苯并芘单克隆抗体。
21、优选地，所述筛选的方法为间接竞争elisa法。
22、优选地，所述骨髓瘤细胞为处于对数生长周期的骨髓瘤细胞sp2/0。
23、优选地，所述脾细胞和骨髓瘤细胞的融合比为(8-12):1，例如可以为8:1、9:1或10:1等。
24、优选地，所述扩大培养是将筛选得到的所述杂交瘤细胞进行2-4次亚克隆，例如可以为2次、3次或4次等，直至所得杂交瘤细胞的阳性率为100％。
25、优选地，所述动物体内培养时，向动物腹腔注射1×106-2×106个所述杂交瘤细胞，例如可以为1.2×106、1.4×106、1.6×106或1.8×106等。
26、优选地，所述动物体内培养操作前一周，先向动物腹腔注射灭菌石蜡。
27、第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的苯并芘免疫亲和柱的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
28、将固相载体活化后与苯并芘单克隆抗体偶联，得到偶联有苯并芘单克隆抗体的固相载体；将所述偶联有苯并芘单克隆抗体的固相载体洗涤后与保存液混合，装入柱管，得到所述苯并芘免疫亲和柱。
29、优选地，所述固相载体活化的活化剂包括溴化氰。
30、优选地，所述洗涤采用的洗涤剂包括tris-hcl缓冲液、醋酸缓冲液。
31、第三方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的苯并芘免疫亲和柱在检测或分离苯并芘中的应用。
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【技术保护点】
1.一种苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述苯并芘免疫亲和柱的填充物包括偶联有苯并芘单克隆抗体的固相载体。
2.根据权利要求1所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述苯并芘单克隆抗体由苯并芘半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；
3.根据权利要求1或2所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述固相载体包括琼脂糖凝胶、聚苯乙烯或硅橡胶中的任意一种；
4.根据权利要求2或3所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述苯并芘半抗原采用如下方法进行制备，所述方法包括：苯并芘衍生物与琥珀酸酐反应得到所述苯并芘半抗原。
5.根据权利要求2-4任一项所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述苯并芘半抗原-载体蛋白偶联物采用如下方法进行制备，所述方法包括：
6.根据权利要求1-5任一项所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述苯并芘单克隆抗体采用如下方法进行制备，所述方法包括：
7.根据权利要求6所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述骨髓瘤细胞为处于对数生长周期的骨髓瘤细胞Sp2/0；
8.一种如权利要求1-7任一项所
9.一种如权利要求1-7任一项所述的苯并芘免疫亲和柱在检测或分离苯并芘中的应用。
10.根据权利要求9所述的苯并芘免疫亲和柱的应用，其特征在于，所述苯并芘免疫亲和柱在检测石油化学剂中苯并芘的应用；
...【技术特征摘要】
1.一种苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述苯并芘免疫亲和柱的填充物包括偶联有苯并芘单克隆抗体的固相载体。
2.根据权利要求1所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述苯并芘单克隆抗体由苯并芘半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；
3.根据权利要求1或2所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述固相载体包括琼脂糖凝胶、聚苯乙烯或硅橡胶中的任意一种；
4.根据权利要求2或3所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述苯并芘半抗原采用如下方法进行制备，所述方法包括：苯并芘衍生物与琥珀酸酐反应得到所述苯并芘半抗原。
5.根据权利要求2-4任一项所述的苯并芘免疫亲和柱，其特征在于，所述苯并芘半抗原-载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：舒勇，江路明，肖啸，刘卫东，丁彬，管保山，王梦颖，韩睿婧，赵桂香，邵黎明，
申请(专利权)人：中国石油天然气股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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