【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种免扩增rna检测荧光传感器及其应用。
技术介绍
1、rna作为生物细胞中的遗传物质，在几乎所有生命过程的基因编码和调控中发挥着不可替代的作用。近年来，它在疾病诊断和预后评估方面的巨大价值也引起了人们的极大关注。细菌16s核糖体rna(bacterial 16s ribosomal rna,rrna)在不同细菌种间高度保守，且在活细胞中含量相对丰富，是种特异性病原体鉴定的理想靶标。非编码rna包括mirna和长链非编码rna(long non-coding rna,lncrna)，是另一类作为调控分子参与生命活动的重要rna，其异常表达已成为恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病的重要诊断和预后生物标志物。
2、尽管逆转录定量聚合酶链反应(rt-qpcr)、northernblots和微阵列分析等传统方法已被用于rna检测，但繁琐的过程、专用设备和训练有素的人员在很大程度上限制了它们在现场检测中的应用。等温扩增技术，包括核酸序列扩增(nesba)、重组酶聚合酶扩增(rpa)和环介导等温扩增(lamp)，虽然能避免复杂的热循环，缩短了检测时间，但是它们的应用仍然受到复杂的引物设计和气溶胶污染风险的限制。现有的crispr相关的核酸检测方法普遍存在在限定的浓度范围内无法检测到太短及低拷贝数的rna的缺陷，灵敏度仅能达到nm级别，并且特异性也不强，rna检测时需要提取非常完整的rna，并且需要将进行cdna合成与引物设计等步骤。
技术实现思路
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2、为了实现上述目的，本专利技术提供了一种免扩增rna检测荧光传感器，包括第一探针、第二探针、t7核酸外切酶、cas12a、crrna、linkerdna、第一富g序列、第二富g序列、硫黄素tht、kcl和水；
3、所述第一探针包括与所述crrna互补序列部分；所述第二探针包括与靶标rna互补序列部分；所述第一探针和第二探针能组装成双链探针；
4、所述linker dna、第一富g序列和第二富g序列能组装成g-四联体；
5、所述cas12a和crrna能识别并切割所述linker dna。
6、优选的，所述第一富g序列的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第二富g序列的核苷酸序列如seq id no.2所示；
7、或，所述第一富g序列的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述第二富g序列的核苷酸序列如seq id no.4所示；
8、或，所述第一富g序列的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述第二富g序列的核苷酸序列如seq id no.6所示；
9、或，所述第一富g序列的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述第二富g序列的核苷酸序列如seq id no.8所示；
10、所述linker dna的核苷酸序列如seq id no.10～14任意一种所示。
11、优选的，所述靶标rna包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、李斯特菌(listeria monocytogenes)、沙门氏菌(salmonella)或大肠埃希氏菌(escherichia coli)的16s rrna的保守序列片段。
12、优选的，所述靶标rna为金黄色葡萄球菌16s rrna的保守序列片段时，所述靶标rna的核苷酸序列如seq id no.15所示，第一探针的核苷酸序列如seq id no.16所示，第二探针的核苷酸序列如seq id no.17所示，crrna的核苷酸序列如seq id no.18所示；
13、所述靶标rna为李斯特菌16s rrna的保守序列片段时，所述靶标rna的核苷酸序列如seq id no.19所示，第一探针的核苷酸序列如seq id no.20所示，第二探针的核苷酸序列如seq id no.21所示，crrna的核苷酸序列如seq id no.22所示；
14、所述靶标rna为沙门氏菌16s rrna的保守序列片段时，所述靶标rna的核苷酸序列如seq id no.23所示，第一探针的核苷酸序列如seq id no.24所示，第二探针的核苷酸序列如seq id no.25所示，crrna的核苷酸序列如seq id no.26所示；
15、所述靶标rna为大肠埃希氏菌16s rrna的保守序列片段时，所述靶标rna的保守序列片段的核苷酸序列如seq id no.27所示，第一探针的核苷酸序列如seq id no.28所示，第二探针的核苷酸序列如seq id no.29所示，crrna的核苷酸序列如seq id no.30所示。
16、本专利技术还提供了上述技术方案所述的免扩增rna检测荧光传感器在制备疾病诊断和/或区分微生物的产品中的应用。
17、本专利技术还提供了上述技术方案所述的免扩增rna检测荧光传感器在非诊断目的的rna和/或微生物检测中的应用。
18、优选的，所述rna和/或微生物检测包括环境和/或食品中rna和/或微生物检测。
19、本专利技术还提供了上述技术方案所述的免扩增rna检测荧光传感器在制备区分微生物产品中的应用。
20、本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述的免扩增rna检测荧光传感器的非诊断目的的rna检测方法，所述rna检测方法包括如下步骤：
21、将第一探针和第二探针组装成双链探针；
22、将所述双链探针、待检测样本、t7核酸外切酶、cas12a、crrna和linker dna混合孵育，得到待检测样本第一产物；
23、将所述双链探针、水、t7核酸外切酶、cas12a、crrna和linkerdna混合孵育，得到空白对照第一产物；
24、将第一富g序列、第二富g序列、硫黄素tht和kcl混合，得到第二产物；
25、将所述待检测样本第一产物和第二产物混合孵育，进行荧光检测，得到待检测样本荧光强度；
26、将所述空白对照第一产物和第二产物混合孵育，进行荧光检测，得到空白对照荧光强度；
27、若所述待检测样本荧光强度和所述空白对照荧光强度差值的绝对值≥2.74a.u.，则所述待检测样本中存在靶标rna；若所述待检测样本荧光强度和所述空白对照荧光强度差值的绝对值＜2.74a.u.，则所述待检测样本中不存在靶标rna。
28、优选的，所述将第一探针和第二探针组装成双链探针的步骤包括：
29、将第一探针、第二探针、nebuffer 3.0缓冲液和无酶水混合，95℃变性5min后，37℃复性1h；
30、所述第一探针、第二探针、nebuffer 3.0缓冲液和无酶水混合所得产物中第一探针和第二本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种免扩增RNA检测荧光传感器，其特征在于，包括第一探针、第二探针、T7核酸外切酶、Cas12a、crRNA、linker DNA、第一富G序列、第二富G序列、硫黄素ThT、KCl和水；
2.根据权利要求1所述的免扩增RNA检测荧光传感器，其特征在于，所述第一富G序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二富G序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
3.根据权利要求1或2所述的免扩增RNA检测荧光传感器，其特征在于，所述靶标RNA包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌(salmonella)或大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的16S rRNA的保守序列片段。
4.根据权利要求3所述的免扩增RNA检测荧光传感器，其特征在于，所述靶标RNA为金黄色葡萄球菌16S rRNA的保守序列片段时，所述靶标RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，第二探针的核苷酸序列如
5.权利要求1～4任一项所述的免扩增RNA检测荧光传感器在制备疾病诊断和/或区分微生物的产品中的应用。
6.权利要求1～4任一项所述的免扩增RNA检测荧光传感器在非诊断目的的RNA和/或微生物检测中的应用。
7.根据权利要6所述的应用，其特征在于，所述RNA和/或微生物检测包括环境和/或食品中RNA和/或微生物检测。
8.一种基于权利要求1～4任一项所述的免扩增RNA检测荧光传感器的非诊断目的的免扩增RNA检测荧光传感器的RNA检测方法，其特征在于，所述RNA检测方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的RNA检测方法，其特征在于，所述将第一探针和第二探针组装成双链探针的步骤包括：
10.根据权利要求8所述的RNA检测方法，其特征在于，所述将所述双链探针、待检测样本、T7核酸外切酶、Cas12a、crRNA和linkerDNA混合孵育的孵育条件为：37℃，60min；
...【技术特征摘要】
1.一种免扩增rna检测荧光传感器，其特征在于，包括第一探针、第二探针、t7核酸外切酶、cas12a、crrna、linker dna、第一富g序列、第二富g序列、硫黄素tht、kcl和水；
2.根据权利要求1所述的免扩增rna检测荧光传感器，其特征在于，所述第一富g序列的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第二富g序列的核苷酸序列如seq id no.2所示；
3.根据权利要求1或2所述的免扩增rna检测荧光传感器，其特征在于，所述靶标rna包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、李斯特菌(listeria monocytogenes)、沙门氏菌(salmonella)或大肠埃希氏菌(escherichia coli)的16s rrna的保守序列片段。
4.根据权利要求3所述的免扩增rna检测荧光传感器，其特征在于，所述靶标rna为金黄色葡萄球菌16s rrna的保守序列片段时，所述靶标rna的核苷酸序列如seq id no.15所示，第一探针的核苷酸序列如seq id no.16...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾兵，张德才，田本顺，凌勇，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：
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