【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于菌种筛选，尤其涉及一种高通量直观筛选酶突变子的方法。
技术介绍
1、酶是一种重要的生物催化剂，包括常见的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶等。酶工程是将酶、微生物细胞、动植物细胞等在一定的生物反应装置中，利用酶的生物催化功能，将其应用于社会生活的一门科学技术。如今，因为酶的多样性和有效性，使其被广泛用作生物催化剂。酶通常在温和的反应条件下起作用，因为具有高度的特异性只催化单一的化学反应或一组密切的反应，所以不会形成不希望的副产物。工业用酶大多在微生物宿主中表达，作为生物催化剂在医药、食品生产、环保、农化和生物传感等领域都取得了显著的成果。但是大多数天然酶在使用中不一定适合工业生产的需要，需要被加以改造令其更加便于生产应用。
2、目前，通过定向进化得到的酶突变子通常使用传统的筛选方法来获取有利突变。定向进化是指在实验室模拟自然进化的过程中，通过诱变和重组加速靶基因的变异，并通过特定的选择条件筛选出符合需求的变体。这里的诱变包括体内的化学基因诱变、体外易错聚合酶链反应以及体外饱和/不饱和位点定向诱变等。通过这些方法，一个含有大量突变子的突变子库可以很容易的建立起来。因此，能否从数量巨大的蛋白质突变子库中高效、快速的筛选出有益突变是决定酶定向进化成功率的关键。然而，传统的一些筛选方法需要大量的人力与时间，已经很难应对酶工程领域面临的挑战，但高通量筛选方法作为酶定向进化中的一项重要技术正在快速地发展。
3、高通量筛选技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，在
技术实现思路
1、专利技术目的：为了解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种高通量直观筛选酶突变子的方法，显著提高了筛选酶突变子的效率，缩短了筛选时间。
2、技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述高通量直观筛选酶突变子的方法，包括如下步骤：
3、(1)制备双层平板培养基：
4、a、制备下层培养基：将蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂粉用去离子水混合定容后灭菌备用，使用前加入过滤除菌的抗性药物和诱导剂；
5、b、制备上层培养基：将蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂粉用去离子水混合定容后灭菌备用，使用前加入过滤除菌的抗性药物；
6、c、待下层培养基凝固后，再加入上层培养基，形成双层平板培养基；
7、(2)制备催化反应底物混合液：将琼脂粉、缓冲液、底物、吐温-80或曲通-100混合；
8、(3)酶突变子快速筛选：将含有载有酶突变基因质粒的菌体涂布在步骤(1)制备的双层平板培养基上，待平板培养基上出现菌落后，加入步骤(2)制备的催化反应底物混合液，待反应底物混合液冷却凝固，放置培养箱培养后取出检视即可。
9、进一步地，所述步骤(1)中抗性药物为卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、链霉素、氯霉素中的任意一种。
10、进一步地，所述步骤(1)中诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)、甲基巯基-d-半乳糖苷、半乳糖、乳糖中的任意一种。
11、进一步地，所述步骤(1)中下层培养基为：蛋白胨5-20g/l，酵母粉2.5-10g/l，氯化钠5-15g/l，琼脂粉15-25g/l，抗性药物50-150mg/l，诱导剂24-480mg/l。
12、进一步地，所述步骤(1)中上层培养基为：蛋白胨5-20g/l，酵母粉2.5-10g/l，氯化钠5-15g/l，琼脂粉15-25g/l，抗性药物50-150mg/l。
13、进一步地，所述步骤(2)中缓冲液为kh2po4-na2hpo4缓冲液、甘氨酸-naoh缓冲液、na2hpo4-柠檬酸缓冲液、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(2-乙磺酸)钠盐(hepes)缓冲液、3-(n-吗啡啉)丙磺酸钠盐(mops)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液中任意一种，所述缓冲液浓度为10-200mm，ph为1-12。
14、进一步地，所述步骤(2)中底物为纤维素、木聚糖、淀粉、油脂、蛋白质中任意一种或几种。
15、进一步地，所述底物为油脂时均质化方式采用超声或高速搅拌乳化。
16、进一步地，步骤(2)中底物为非油脂，则均质化方式采用加热搅拌促进其溶解。
17、进一步地，所述底物为油脂时添加1-6％聚乙烯醇。
18、进一步地，所述步骤(3)中所述检视为检视菌落周围与无菌落部分所呈现的色差或折光差异，筛选所需酶突变子。
19、如图1所示，本专利技术制作双层平板培养基，使诱导剂位于双层平板培养基下层，不直接接触菌体以防止其抑制菌体的初期生长；利用诱导剂从下层培养基扩散至上层培养基表面的时间差，为菌体生长留有时间，当诱导剂扩散至长成的菌落后，诱导其产酶；于催化反应底物混合液中添加的吐温-80或者曲通-100等细胞通透剂增加了细胞的通透性，促进细胞内部异源表达的酶释放至细胞外部，使铺上催化底物混合液后形成的催化反应结果更加易于筛选酶突变子，该专利技术操作简单，提高了效率，便于高通量直观筛选。
20、本专利技术首次将培养菌体和诱导菌体产酶融为一体，利用诱导剂从下层培养基扩散至上层培养基表面与诱导剂开始诱导菌体产酶的时间差，当上层培养基表面的菌落长成为一定大小后，诱导剂恰好扩散至上层培养基并开始诱导菌体产出足够多的可以进行实验筛选的酶量；同时，现有的技术中尚未发现一种可以高通量直观筛选酶突变子的方法，于大肠杆菌细胞内诱导产生的酶往往通过细胞破碎的方式释放，进而检测其活性，本专利技术首次利用增大细胞的通透性将胞内产生的酶尽可能多地释放于胞外，避免了细胞破碎等复杂步骤，提高筛选效率。
21、有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：
22、本专利技术方法不需要单独进行菌株的诱导和破碎而快速高效筛选出产有效突变酶的菌株。传统酶突变子筛选方法包括摇瓶、转接菌、诱导、破碎和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述步骤(1)中下层培养基为：蛋白胨5-20g/L，酵母粉2.5-10g/L，氯化钠5-15g/L，琼脂粉15-25g/L，抗性药物50-150mg/L，诱导剂24-480mg/L。
3.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述步骤(1)中上层培养基为：蛋白胨5-20g/L，酵母粉2.5-10g/L，氯化钠5-15g/L，琼脂粉15-25g/L，抗性药物50-150mg/L。
4.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述步骤(1)中抗性药物为卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、链霉素、氯霉素中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述步骤(1)中诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、甲基巯基-D-半乳糖苷、半乳糖、乳糖中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征
7.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述步骤(2)中底物为纤维素、木聚糖、淀粉、油脂、蛋白质中任意一种或几种。
8.根据权利要求7所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述底物为油脂时均质化方式采用超声或高速搅拌乳化。
9.根据权利要求7所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述底物为油脂时添加1-6％聚乙烯醇。
10.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，步骤(3)中所述检视为检视菌落周围与无菌落部分所呈现的色差或折光差异，筛选所需酶突变子。
...【技术特征摘要】
1.一种高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述步骤(1)中下层培养基为：蛋白胨5-20g/l，酵母粉2.5-10g/l，氯化钠5-15g/l，琼脂粉15-25g/l，抗性药物50-150mg/l，诱导剂24-480mg/l。
3.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述步骤(1)中上层培养基为：蛋白胨5-20g/l，酵母粉2.5-10g/l，氯化钠5-15g/l，琼脂粉15-25g/l，抗性药物50-150mg/l。
4.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述步骤(1)中抗性药物为卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、链霉素、氯霉素中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的高通量直观筛选酶突变子的方法，其特征在于，所述步骤(1)中诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)、甲基巯基-d-半乳糖苷、半乳糖、乳糖中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的高通量直观...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭中标，葛飞吟，赵一品，钱敏菁，陈港，时号，朱小燕，
申请(专利权)人：淮阴工学院，
类型：发明
国别省市：
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