【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸测序，尤其涉及一种延伸试剂缓冲液，一种延伸试剂缓冲液的应用，一种延伸试剂盒，以及一种测序方法。
技术介绍
1、下一代测序，也称为高通量测序或者大规模平行测序，能够在一次测序运行中测定多个样本的核酸序列。比较常见的下一代测序方法有边连接边测序(sequencing byligation,sbl)和边合成边测序(sequencing by synthesis,sbs)。基于sbs实现核酸测序的平台，是基于碱基配对原则、利用dna聚合酶使核苷酸(包括核苷酸类似物)连接到与模板结合的引物的3'末端以可控地实现单碱基延伸，通过采集每次核苷酸类似物结合后所引起的信号变化，进而基于该些采集的信号的变化确定模板的碱基排列次序。一种典型的sbs方法可以包括如下步骤：(1)使待测核酸分子与固相载体表面上的探针杂交以将待测核酸模板连接至该固相载体表面；(2)在dna聚合酶的作用下、在适于聚合酶链式反应的条件下，以探针为引物使带有荧光基团的核苷酸类似物掺入到核酸模板上(形成互补链)，从而实现单碱基延伸；(3)激发核苷酸类似物上的荧光基团发光，进而对表面进行成像以采集表面上的发光信号；(4)去除结合到待测核酸链上的核苷酸类似物中的荧光基团；(5)重复上述步骤(2)和步骤(4)使待测核酸链得以继续延伸。进一步的，sbs方法还包括步骤(6)：通过对步骤(3)中得到的光学信号进行分析，以确定每轮延伸反应中掺入到核酸模板上的核苷酸类似物的类型；按顺序读取引入的核苷酸类似物类型，最终实现获得待测链的所有核苷酸序列。
2、将核苷酸类似物
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种延伸试剂缓冲液及其应用、延伸试剂、测序方法，旨在解决目前将核苷酸类似物掺入到核酸模板的过程中容易产生相位误差，影响测序信号的识别，进而降低待测核苷酸分子的测序准确率的问题。
2、为实现上述申请目的，本申请实施例采用的技术方案如下：
3、第一方面，本申请提供一种延伸试剂缓冲液，至少包括基础缓冲液、k+和nh4+，其中，所述k+的浓度为50～100mmol/l，所述nh4+的浓度为150～350mmol/l，所述延伸试剂缓冲液的ph为8.9～9.4。
4、本申请提供的延伸试剂缓冲液，综合平衡缓冲液中ph以及k+和nh4+的浓度，可使得聚合酶在延伸试剂缓冲液中促进核酸分子延伸的活性提高，进而提高核酸分子的延伸效率，降低相位滞后现象，最终提高待测核苷酸分子的测序准确率。该延伸试剂缓冲液提高聚合酶反应活性的方式可能为：延伸试剂缓冲液中ph以及k+和nh4+的浓度在上述范围时，延伸试剂缓冲液改变了聚合酶蛋白表面的电荷分布，调整聚合酶的等电点，从而调整聚合酶与核酸分子之间、聚合酶与延伸试剂缓冲液之间的相互作用，使聚合酶更容易作用于核酸分子；另外，延伸试剂缓冲液改变核酸分子在延伸试剂缓冲液中的空间构象，使聚合酶更容易结合在核酸分子的反应位点。
5、作为本申请延伸试剂缓冲液的一种可能的实施方式，所述延伸试剂缓冲液的ph为8.9～9.1，所述k+的浓度为50～70mmol/l，所述nh4+的浓度为150～230mmol/l。
6、作为本申请延伸试剂缓冲液的一种可能的实施方式，所述延伸试剂缓冲液的ph为9.05～9.35，所述k+的浓度为60～90mmol/l，所述nh4+的浓度为200～310mmol/l。
7、作为本申请延伸试剂缓冲液的一种可能的实施方式，所述延伸试剂缓冲液的ph为9.3～9.5，所述k+的浓度为80～100mmol/l，所述nh4+的浓度为300～350mmol/l。
8、结合上述三种实施方式配制的延伸试剂缓冲液，可以更明显地看到延伸试剂缓冲液对相位滞后现象的改善作用。
9、作为本申请延伸试剂缓冲液的一种可能的实施方式，所述k+为氢氧化钾、卤化钾、有机羧酸钾和硫酸钾中的至少一种提供的k+。也就意味着，在本申请的实施方式中，延伸试剂缓冲液中含有氢氧化钾、卤化钾、有机羧酸钾和硫酸钾中的至少一种，或者在配置延伸试剂缓冲液的过程中，添加氢氧化钾、卤化钾、有机羧酸钾和硫酸钾中的至少一种，至少用于提供k+。其中，氢氧化钾作为k+源，还可以通过其阴离子调节延伸试剂缓冲液的ph，以丰富基础缓冲液以及其他用于调节ph或对ph有影响的试剂的选择。
10、作为本申请延伸试剂缓冲液的一种可能的实施方式，所述nh4+为硫酸铵、有机铵和氨水中的至少一种提供的nh4+。也就意味着，在本申请的实施方式中，延伸试剂缓冲液中含有硫酸铵、有机铵和氨水中的至少一种，或者在配置延伸试剂缓冲液的过程中，添加硫酸铵、有机铵和氨水中的至少一种，至少用于提供nh4+。其中，氨水作为nh4+源，同样可以调节延伸试剂缓冲液的ph，以丰富基础缓冲液以及其他用于调节ph或对ph有影响的试剂的选择。
11、作为本申请延伸试剂缓冲液的一种可能的实施方式，所述延伸试剂缓冲液含有氢氧化钾和硫酸铵。此时，配置延伸试剂缓冲液时，氢氧化钾提供k+，且其产生的oh-还能调节延伸试剂缓冲液的ph。同时，硫酸铵至少提供延伸试剂缓冲液所需的部分nh4+，或者nh4+完全来源于硫酸铵，因此，可以降低延伸试剂缓冲液中其他nh4+源特别是氨水的含量，甚至可将氨水含量降至0，即配置延伸试剂缓冲液时不加氨水。由此，可以降低氢氧化钾和氨水对延伸试剂缓冲液ph的双层影响，有利于调控延伸试剂缓冲液的ph，以获得预期的ph值。
12、作为本申请延伸试剂缓冲液的一种可能的实施方式，所述延伸试剂缓冲液包括有机羧酸钾和硫酸钾中的至少一种和氨水。此时，延伸试剂缓冲液的配置过程中，由于氨水可影响延伸试剂缓冲液ph，因此，当k+来源于有机羧酸钾和硫酸钾，可降低或避免诸如氢氧化钾的影响ph的试剂含量，从而降低诸如氢氧化钾的影响ph的试剂与氨水联合作用加强对延伸试剂缓冲液ph的影响，从而有利于调控延伸试剂缓冲液，获得预期的ph。
13、作为本申请延伸试剂缓冲液的一种可能的实施方式，所述基础缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、乙醇胺、四乙基乙二胺、四甲基乙二胺、n-丁基二乙醇胺、二乙氨基乙醇、hepes缓冲液、n,n-二羟乙基甘氨酸中的至少一种。上述基础缓冲液用于调节延伸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种延伸试剂缓冲液，其特征在于，至少包括基础缓冲液、K+和NH4+，其中，所述K+的浓度为50～100mmol/L，所述NH4+的浓度为150～350mmol/L，所述延伸试剂缓冲液的pH为8.9～9.4。
2.如权利要求1所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述延伸试剂缓冲液的pH为8.9～9.1，所述K+的浓度为50～70mmol/L，所述NH4+的浓度为150～230mmol/L；或
3.如权利要求1或2所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述K+为氢氧化钾、卤化钾、有机羧酸钾和硫酸钾中的至少一种提供的K+；和/或
4.如权利要求3所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述延伸试剂缓冲液含有氢氧化钾和硫酸铵；或
5.如权利要求1至4任一项所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述基础缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、乙醇胺、四乙基乙二胺、四甲基乙二胺、N-丁基二乙醇胺、二乙氨基乙醇、Hepes缓冲液、N,N-二羟乙基甘氨酸中的至少一种；
6.如权利要求5所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述其他助剂包括磷酸化合物，
7.如权利要求6所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，式(1)中，R1、R2中至少一个为氢原子，R3选自碳原子数为1～10的烷基、环烷基，碳原子数为6～20的芳基中的一种；或
8.如权利要求6所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，式(2)中，R1选自氢原子，R2选自金属离子；
9.如权利要求6至8任一项所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述磷酸化合物选自植酸钠、焦磷酸二氢二钠和双酚A双(二苯基磷酸酯)中的任意一种或至少两种的组合。
10.如权利要求1至9任一项所述的延伸试剂缓冲液在核酸测序领域中的应用。
11.一种延伸试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至9任一项所述的延伸试剂缓冲液；
12.一种测序方法，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种延伸试剂缓冲液，其特征在于，至少包括基础缓冲液、k+和nh4+，其中，所述k+的浓度为50～100mmol/l，所述nh4+的浓度为150～350mmol/l，所述延伸试剂缓冲液的ph为8.9～9.4。
2.如权利要求1所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述延伸试剂缓冲液的ph为8.9～9.1，所述k+的浓度为50～70mmol/l，所述nh4+的浓度为150～230mmol/l；或
3.如权利要求1或2所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述k+为氢氧化钾、卤化钾、有机羧酸钾和硫酸钾中的至少一种提供的k+；和/或
4.如权利要求3所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述延伸试剂缓冲液含有氢氧化钾和硫酸铵；或
5.如权利要求1至4任一项所述的延伸试剂缓冲液，其特征在于，所述基础缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、乙醇胺、四乙基乙二胺、四甲基乙二胺、n-丁基二乙醇胺、二乙氨基乙醇、hepes缓冲液、n,n-二羟...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文，尚欢，许定，刘磊，陈方，
申请(专利权)人：深圳市真迈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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