【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药分析，具体涉及一种检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法。
技术介绍
1、阿尔兹海默病(alzheimer's disease,ad)是一种临床和病理生理学异质性的复杂神经退行性疾病，是与年龄相关的神经退行性疾病的最常见原因。阿尔茨海默氏病被认为在症状出现前20年或更长时间开始，大脑发生变化，受影响的人无法察觉。只有经过多年的退行性变化，个体才会出现明显的症状，例如记忆力减退和语言问题。随着疾病的进展，大脑其他部分的神经元受到损害。个人逐渐卧床不起，需要全天候的护理，ad最终是致命的。
2、伴随认知、功能、行为上的损害，阿尔茨海默病有两个经典的病理学特征：细胞外β-淀粉样蛋白(aβ)斑块和细胞内磷酸化tau神经原纤维缠结(nft)的逐渐积累。在ad中，聚集的aβ斑块由于aβ清除减少或过量产生而沉积在大脑内，斑块沉积通常发生在认知障碍发作前约20年。nft是由过度磷酸化的tau蛋白异常积累形成的，这些可以在症状出现前10-15年被发现。目前可以使用脑脊液(cerebrospinal fluid，csf)或成像技术检测aβ、tau蛋白变性，aβ-pet和tau-pet扫描为诊断的金标准。然而，csf需要患者配合做腰椎穿刺，侵入性强。而pet设备只有少数医疗中心有实力配置，检测费用昂贵，极大的限制了这些标志物作为一线诊断工具应用。因此，侵入性较小且具有成本效益的生物标志物是理想的解决方案，基于血液的ad标志物很可能会满足这一需求。
3、2018年，美国国家老龄化研究所-阿尔茨海
4、β-淀粉样蛋白由细胞膜上的淀粉样前体蛋白(app)通过β-分泌酶和γ-分泌酶裂解成的含40个氨基酸的aβ40和42个氨基酸残基的aβ42。schupf、blasko等发现在痴呆后老年人群中，血浆aβ42下降，同时血浆aβ42/aβ40比值也下降。csf中aβ42/aβ40在pet阳性与阴性个体差异约30％。相对于csf，血浆中aβ阳性与阴性个体间aβ42/aβ40差异较小，因此，临床上对来自血浆样本aβ40、aβ42定量提出了更精准的要求。
5、临床上迫切需要准确、可靠和客观的生物标志物来帮助早期诊断和监测阿尔茨海默氏病，随着技术的发展产生了很多候选生物标志物，但其中极少数对临床有用，主要限制因素在于测试的灵敏度、精密度等方法学问题。
6、当前，几乎所有的ad脑脊液和血液中生物标志物的鉴定都是基于抗体的平台试验，通常具有较高的变异性，特别是当使用不同的抗体，校准物以及样品制备等，导致了不同实验室结果不一致，csf中aβ42免疫测定的标准化已被证明是困难的。因具有高灵敏度、准确性和高通量分析能力，靶向质谱定量是潜在有效的替代方法。质谱仪种类较多，工作原理和应用范围也有很大的不同，以可检测的目标物质荷比(m/z)范围和分辨率来划分，主要有可分为低分辨和高分辨两个主要应用平台。低分辨质谱可分析2～2000m/z的目标分子，其中大部分为液相色谱-串联质谱平台，质量分析器为三重四级杆，其临床应用中占比约60％～70％。高分辨质谱在m/z 200处分辨率可达百万，能精密的分析复杂蛋白的微小差异，但费用昂贵，多为科研机构购置，医学实验室极少配置，也未曾应用于临床一线检测。
7、已报道的对β-淀粉样蛋白的质谱定量方法也是基于高分辨质谱平台，因血浆中aβ含量极低，且杂蛋白干扰物多，高分辨质谱采用靶向定量平行反应监测扫描模式，可实现对β-淀粉样蛋白的定量要求。总之，基于质谱对复杂蛋白优异的区分能力，能精确监测由样本处理和复杂蛋白干扰引起的变异性，提供了强大而灵敏的目标蛋白及特征肽段的定量检测解决方案，未来将在神经退行性疾病领域诊断中发挥重要作用。然而现有技术中，因基于三重四级杆类型的液相色谱-串联质谱平台灵敏度、分辨率都远低于高分辨质谱，因此满足β-淀粉样蛋白极低定量限十分困难，而高端的高分辨质谱提供了优异的分析能力，却也同时带来了临床应用可及性的问题，此外，现有技术中也未见文献报道基于四级杆质谱平台对β-淀粉样蛋白的定量。
8、综上所述，本领域迫切需要一种检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，基于三重四级杆液相色谱-串联质谱平台，实现对血浆中β-淀粉样蛋白的定性定量检测，且侵入性小、定量限低、操作简便、成本可控，有利于神经退行性疾病的早期筛查与诊断。
技术实现思路
1、因基于三重四级杆类型的液相色谱-串联质谱平台灵敏度、分辨率都远低于高分辨质谱，因此满足β-淀粉样蛋白极低定量限十分困难，也未见文献报道基于四级杆质谱平台对β-淀粉样蛋白的定量。高端的高分辨质谱提供了优异的分析能力，但同时带来了临床应用可及性的问题。针对上述β-淀粉样蛋白检测存在的灵敏度、精密度等问题，同时为保证检测的样本、设备的可及性，更好的服务病患，本专利技术创新性的应用医疗系统最为普及的，以三重四级杆为质量分析器的液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)仪器平台，开发了基于血浆样本的β-淀粉样蛋白免疫沉淀-质谱(immunoprecipitation-ms,ip-ms)的检测方法，可以有效筛查早期ad中aβ病理的存在。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，所述方法包括以下步骤：
3、s1、建立校准曲线：采用5％bsa配制aβ40校准曲线工作液并建立校准曲线，采用5％bsa配制aβ42校准曲线工作液并建立校准曲线，所述aβ40校准曲线工作液和aβ42校准曲线工作液保存在-20℃条件下；
4、s2、样本采集：采用edta真空采血管收集血浆样本，-20℃保存，反复冻融次数低于5次；
5、s3、抗体偶联：取抗-β-淀粉样蛋白抗体，采用磁珠和磷酸钠缓冲液对所述抗-β-淀粉样蛋白抗体进行抗体偶联，得到磁珠-抗体复合物；
6、s4、富集：取s2采集得到的血浆，加入aβ40和aβ42的混合内标，再加入pbs缓冲液和s3得到的磁珠-抗体复合物，混合孵育后，进行清洗、磁吸和洗脱，再加入brcn进行孵育，氮气吹干后使用纯水复溶，得到待测样本；
7、s5、上样检测：将待测样本上样进行液相色谱串联质谱检测，使用的质量分析器为三重四极杆，采用内标法，以n15 beta-amyloid 1-40和n15 beta-amyloid 1-42为内标，计算待测样本中的aβ40和aβ42的浓度；
8、其中，液相色谱的条件为：
9、色谱柱型号为uplc beh c18，2.1mm×100mm，1.7μm；流动相a为10％甲醇-水溶液，流动相b为0.02％甲酸-90％乙腈；流速为0.3ml/min；柱温本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，S3中，所述抗-β-淀粉样蛋白抗体为抗-β-淀粉样蛋白(13-28)抗体，所述磁珠为Dynabeads M-270环氧树脂。
3.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，S3中，所述抗体偶联的步骤包括：
4.根据权利要求3所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述Buffer E2为含0.1％BSA和0.1％Tween20的混合缓冲液。
5.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S4中，所述血浆与混合内标的添加量之比为40:1～50:1，所述血浆与磁珠-抗体复合物的添加量之比为17:1～20:1。
6.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S4中，混合孵育的时间为60
7.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S4中，清洗是指采用1mL的1×PBS清洗混合液三次，再使用1mL的超纯水清洗三次。
8.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S4中，洗脱是指使用50μL的2％氨水-乙腈进行洗脱。
9.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S4中，加入BrCN进行孵育的条件为在4℃下孵育2小时。
10.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述Aβ40校准曲线工作液包含9个浓度值，所述Aβ40校准曲线工作液的浓度范围为2、5、10、20、50、100、200、500和1000pg/mL，所述Aβ42校准曲线工作液包含9个浓度值，所述Aβ42校准曲线工作液的浓度范围为2、5、10、20、50、100、200、500和1000pg/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，s3中，所述抗-β-淀粉样蛋白抗体为抗-β-淀粉样蛋白(13-28)抗体，所述磁珠为dynabeads m-270环氧树脂。
3.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，s3中，所述抗体偶联的步骤包括：
4.根据权利要求3所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述buffer e2为含0.1％bsa和0.1％tween20的混合缓冲液。
5.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述s4中，所述血浆与混合内标的添加量之比为40:1～50:1，所述血浆与磁珠-抗体复合物的添加量之比为17:1～20:1。
6.根据权利要求1所述的检测血浆中β-淀粉样蛋白的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱磊，汤彩云，李渊，王金玉，韩颖鑫，
申请(专利权)人：苏州药明泽康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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