一种稳定性高的25-羟基维生素D的检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种稳定性高的25

【技术实现步骤摘要】
一种稳定性高的25
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羟基维生素D的检测方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及体外诊断
，具体涉及一种稳定性高的25
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羟基维生素D的检测方法及检测试剂盒。

技术介绍

[0002]维生素D(简称VD)是一种类固醇激素，与健康关系较为密切的是维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。维生素D可促进肠道钙吸收，具有维持钙磷代谢平衡的功能，缺乏可致佝偻病、骨质软化症和骨质疏松症。过量的维生素D也会对人体造成伤害，长期维生素D过多时，高钙血症可致动脉粥样硬化，广泛性软组织钙化和不同程度的肾功能受损，严重者可致死。维生素D在肝脏中经25
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羟化酶作用下转化为25
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羟基维生素D[25(OH)D]，再经过肾脏中线粒体细胞色素P450氧化酶(1
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α羟化酶)的催化转化为有生物活性的1，25
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二羟基维生素D[1,25
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(OH)2D]。维生素D、25(OH)D和1,25
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(OH)2D在人体内的半衰期分别为24h、3周和4h，其中25(OH)D是机体维生素D的主要储存形式，占总量的95％以上近年来的研究表明25(OH)D水平还与肿瘤、心血管疾病、免疫系统疾病、心脏疾病等有关。一般植物性食物中维生素D含量较低，维生素D可通过皮肤暴露阳光或紫外线在体内合成。25(OH)D是血液循环中多种维生素D代谢产物中含量最多且最稳定的一种，可代表体内维生素D营养状态，因此，监测血清或血浆25(OH)D是评价维生素D营养状况的最佳指标。
[0003]维生素D缺乏是全球性问题，我国人群维生素D不足现象也较为普遍，临床维生素D检测成为了一种必不可少的监控措施，根据血药浓度水平与临床反应对药物剂量进行调整，可有效减小剂量过小引发的疗效不佳或剂量过大引发的不良反应及药物的毒副作用，根据血清或者血浆25(OH)D值，结合临床高危因素，以决定个体是否需维生素D治疗。
[0004]维生素D是一种脂溶性维生素，乃环戊烷多氢菲类化合物，分子结构上含不饱和双键，氧化剂、紫外线、热等因素能诱导构想变化及双键断裂，影响维生素D化合物及其代谢物25(OH)D的稳定性。目前各体外诊断厂商多数采用冻干粉剂型及降低保存温度的方法来延缓25(OH)D的降解。
[0005]目前，维生素D的检测方法按照检测原理可分成免疫法和色谱法两大类。市场上维生素D血药浓度测定试剂盒主要使用免疫方法，包括放射免疫法(RIA)、化学发光免疫法(CLIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。但免疫分析法准确度不足，特异性差，不能区分25(OH)D2和25(OH)D3，只能用于检测25(OH)D总量，且易与血液中其它相似结构代谢产物发生交叉反应。液相色谱
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质谱联用技术(LC
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MS/MS)结合了液相色谱的高分离性和质谱仪很强的分离鉴定的能力，具有高灵敏度、高特异性和高精准度等特点，被国际公认为检测的“金标准”。研究表明，用LC
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MS/MS检测血清25(OH)D能够有效地避免免疫法存在的交叉反应、25(OH)D2和25(OH)D3识别率不一致等问题，且能够同时分别测定25(OH)D2和25(OH)D3的浓度。
[0006]但是，国内目前25(OH)D的监测多以各医学实验室自建方法的形式开展，溯源链及方法缺乏统一的标准。另外，实验室之间资质与能力有较大差别，给监管造成较大困难，同
时由于这些自建方法均未在《医疗机构临床检验项目目录(2013版)》中，因此，其大规模开展面临法规问题。本研究根据体外诊断试剂(In vitro diagnostics，IVD)行业监管要求，开发了25(OH)D LC
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MS/MS试剂盒，产品具有明确的溯源链。试剂盒性能、工艺参数与批间差、稳定性等性能指标满足IVD产品注册标准及法规的要求，保证了方法的标准化、统一化，为临床应用提供了保障。
[0007]此外，目前现有的试剂盒普遍存在以下缺陷：
[0008]1、稳定性差，剂型多为冻干粉，体外诊断试剂根据组成结构和反应原理等可分为不同类别，各类别产品组成成分也比较复杂，许多体外诊断试剂本身就是生物试剂。一些体外诊断试剂组成成分的活性基团会有不同的化学不稳定性趋向，容易发生水解、酶解和氧化等反应，从而影响到试剂的质量和稳定性。如含有多肽类的冻干粉试剂，其储存环境中的含水量和含氧量对试剂稳定性的影响非常大。因此体外诊断试剂稳定性研究的目的是为了了解体外诊断试剂成品在各种因素影响下质量变化情况。影响体外诊断试剂质量的因素包括温度、湿度、振动、氧化和光照等。
[0009]由于25(OH)D的不稳定性，无论是实验室自建方法还是已上市试剂盒，其为提高稳定性主要采用冷冻干燥工艺，产品的干燥在0℃以下进行，主要优点有，物质中的一些挥发性成分损失很小；微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性状；物料保持原来的化学组成和结构，不会发生浓缩现象；干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护；干燥能排除95
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99％以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质；干燥后的物质，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。因此，冷冻干燥在医药工业，体外诊断行业，科研和其他部门得到广泛的应用。但在体外诊断行业，常规试剂为液体剂型。若产品稳定性差，常规方法不能有效解决，剂型才会考虑做成冻干粉。冻干粉工艺复杂，生产成本高，且产品上市后用户必须首先加入稀释溶液进行复溶，增加了用户端的操作步骤，同时影响了检测的重复性，精密度劣于液体剂型。另外25(OH)D复溶后的稳定性依旧很短，通常在1个月以内，未根本性的解决产品的稳定性问题。
[0010]2、试剂的保存多采用低温冷冻，增加了仓储和运输的不便，能耗较高，体外诊断试剂的稳定性通常与温度有直接关系，降低保存温度可延缓生物化学反应的进程，降低氧化速率，从而提高了产品与试剂的稳定性。体外诊断试剂大多含有小分子化合物、抗原、抗体、酶等物质，温度的变化易导致化合物的降解及生物活性的改变，因此试剂储存上多数采用冷藏(2
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8℃)，少数采用冷冻(
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20℃及以下温度)。目前25(OH)D部分已上市试剂盒采用
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20℃冷冻保存方式，并在产品说明书中做出了规定。因此，其对运输方式及转运途中温度监控，以及用户端保存的要求较为繁琐。另外，生产方、使用方、运输过程都必须依法确保符合说明书指定的保存温度，这大大增加了研发生产费用和客户使用成本。
[0011]3、传统方法正确度、精密度差，随着近年来25(OH)D临床检测应用的逐渐走热，国内25(OH)D已上市的试剂盒已近上百个产品，但大多数为免疫法。其未能有效区分25(OH)D2和25(OH)D3，检测重复性、准确度较差，一定程度上影响了临床决策和治疗。研究发现检测结果存在差异的主要原因是检测抗体的特异性差异、解离结合蛋白的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定性高的25
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羟基维生素D的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)配制稳定化25
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羟基维生素D校准品，所述稳定化25
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羟基维生素D校准品包括25(OH)D2校准品和25(OH)D3校准品，所述稳定化25
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羟基维生素D校准品的基质采用动物基质，所述动物基质为动物血清或血浆，所述动物血清为新生牛血清、小牛血清、大牛血清、胎牛血清中的一种；2)配制稳定化25
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羟基维生素D质控品，所述稳定化25
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羟基维生素D质控品包括低浓度25(OH)D2质控品、中浓度25(OH)D2质控品、高浓度25(OH)D2质控品、低浓度25(OH)D3质控品、中浓度25(OH)D3质控品和高浓度25(OH)D3质控品，所述稳定化25
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羟基维生素D质控品的基质采用动物基质，所述动物基质为动物血清或血浆，所述动物血清为新生牛血清、小牛血清、大牛血清、胎牛血清中的一种；3)配制样本萃取液，所述样本萃取液的组成成分包括25(OH)D2
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d3、25(OH)D3
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d6和乙腈；4)向前处理容器中加入配制好的稳定化25
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羟基维生素D校准品、稳定化25
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羟基维生素D质控品和待测样本，再加入配制好的样本萃取液进行前处理，作为上样分析备用；5)使用液相色谱质谱联用仪，结合内标法，对待测样本进行色谱质谱检测，得到待测样本中25(OH)D2和25(OH)D3的浓度；6)分析检测结果，将所述待测样本中25(OH)D2的浓度和25(OH)D3的浓度相加，得到待测样本中的25
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羟基维生素D的浓度。2.根据权利要求1所述的稳定性高的25
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羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述动物基质的制备方法包括以下步骤：S1、在分液漏斗中加入动物血清和处理溶剂，所述处理溶剂为乙酸乙酯和正己烷，所述乙酸乙酯和正己烷的体积比为9:1，振荡25min，静置分层，分离动物血清和处理溶剂；S2、加入正己烷，振荡3min，静置分层，分离动物血清和正己烷，对获得的产物进行离心，离心后取上清液于2
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8℃环境下敞口放置24小时。3.根据权利要求1所述的稳定性高的25
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羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述25(OH)D2校准品中25(OH)D2的浓度为2～64ng/mL，所述25(OH)D3校准品中25(OH)D3的浓度为5～160ng/mL。4.根据权利要求1所述的稳定性高的25
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羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述样本萃取液中25(OH)D2
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d3的浓度为40ng/mL，所述样本萃取液中25(OH)D3
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d6的浓度为80ng/mL。5.根据权利要求1所述的稳定性高的25
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羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述稳定化25
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羟基维生素D校准品和稳定化25
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羟基维生素D质控品中的动物基质中均添加有防腐剂，所述防腐剂为硫酸链霉素。6.根据权利要求1所述的稳定性高的25
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羟基维生素D的检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述前处理是指将100μL校准品、100μL质控品和100μL待测血清样本分别置于前处理容器，加入200μL样本萃取液，封膜后在950rpm条件下振荡10min，再于4℃、4000rpm条件下离心10min，最后取230μL上清液，在4℃、4000rpm条件下离心3min。7.根据权利要求1所述的稳定性高的25
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羟基维生素D的检测方法，其特征在于，步骤5)中，所述内标法的内标物为25(OH)D2
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d3和25(OH)D3
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d6。
8.根据权利要求1所述的稳定性高的2...

【专利技术属性】
技术研发人员：方焯，刘釜均，朱磊，张新星，张天，徐敏强，
申请(专利权)人：苏州药明泽康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：