【技术实现步骤摘要】
本申请涉及大曲中生物酶活性检测，特别是涉及一种大曲中多种生物酶活性的检测方法。
技术介绍
1、大曲作为我国白酒酿造的重要物质基础，亦是我国最早、最原始的粗酶制剂。大曲中各种微生物产生的生物酶系可用于固态白酒发酵过程中各类生化反应，并进一步降解发酵原料以促进利用。在大曲制作及贮存过程中，大曲中的微生物会代谢产生蛋白酶、糖化酶、液化酶、果胶酶和单宁酶等，进而提供发酵所必需的丰富生物催化剂。
2、随着对大曲中微生物种类及其功能与生物酶关联地深入研究，使大曲生物酶系对固态白酒酿造过程重要性日趋显现。大曲中各类生物酶系的特点与功能，不仅影响着大曲白酒的出酒率，亦赋予各类大曲白酒独特的酒体风格，更是决定大曲白酒产质量的重要因素。
3、目前，大曲中各生物酶活性多采用滴定法和分光光度法进行定量测定，现存检测方法具有终点判断主观性强，前处理操作繁琐，多成分显色反应亦严重影响了部分生物酶活性的准确定量分析。在大曲生物酶活性的研究中，由于生物酶在理化性质、酶学性质和分子结构等方面较复杂。
4、因此，亟需建立准确、高效和快速的大曲中多种生物酶活性的检测方法。
技术实现思路
1、本申请实施例提供一种大曲中多种生物酶活性的检测方法，包括：
2、s10：大曲中生物酶酶解产物提取，包括：
3、s11：提取大曲中的酶，获得大曲酶液；
4、s12：获取与活性待测的多种生物酶一一对应的多种生物酶底物，并将各种生物酶底物分开加入到大曲酶液，得到多种酶
5、s13：将各种大曲酶解液定容，混匀；
6、s14：混匀后再进行高速低温离心处理，取离心后的第一上清液；
7、s15：过滤第一上清液并收集滤液待测，一种大曲酶解液对应得到一种滤液，滤液包括大曲酶解液中的酶解产物；
8、s20：采用uplc-hrms联用仪分别测定各种滤液并对测定结果定性定量分析，得到大曲中多种生物酶活性。
9、本申请提供的大曲中多种生物酶活性的检测方法准确性高和检测能力强，利用uplc-hrms联用仪建立了大曲中多种生物酶活性准确定量的检测方法，结合高分辨质谱仪可实现准确定性定量分析大曲酶解液中各酶解产物的含量，进而计算可知多种微量生物酶活性。对大曲中生物酶酶解产物提取步骤操作方便、快速，无需有机溶剂提取，实验成本低且低毒环保。本申请提供的大曲中多种生物酶活性的检测方法适用性强，可适合大曲样多种生物酶活性分析。本申请采用了高灵敏度，高分辨率和强抗干扰能力的uplc-hrms联用仪进行分析，因此具有操作准确、灵敏度高及重复性好等优点。
10、在本申请一些可选的实施例中，s11的步骤包括：
11、粉碎大曲制得曲粉，用超纯水溶解曲粉得到第一混合液，将第一混合液置于40℃下恒温水浴第一预设时长，恒温水浴过程中间歇振荡第一混合液，恒温水浴完成后离心取第二上清液，作为大曲酶液。
12、在本申请一些可选的实施例中，s12的步骤，包括：
13、制取第一组大曲酶液，第一组大曲酶液中液体份数与生物酶底物数量对应相等，第一组大曲酶液中各份大曲酶液分别经水浴预热到达各目标酶解温度tj，
14、各种生物酶底物也预热达到自身对应的目标酶解温度tj，
15、各种生物酶底物分别加入对应的各份大曲酶液中形成各种待酶解反应液，各种待酶解反应液在对应的各目标酶解温度tj下分别反应预设时间tn，得到对应的各种酶解液，
16、对各种酶解液沸水浴处理以停止酶解反应，冷却待用。
17、在本申请一些可选的实施例中，s12的步骤，还包括：
18、制备空白对照分析液，制取第二组大曲酶液，第二组大曲酶液中液体份数与生物酶底物数量对应相等，先对第二组大曲酶液中所有大曲酶液沸水浴处理使得酶失活，
19、并将第二组大曲酶液中各大曲酶液降温至各目标酶解温度tj，继而在第二组大曲酶液的各大曲酶液中对应加入各种生物酶底物形成各种待测液，加入时各种生物酶底物已预热到自身对应的目标酶解温度tj，
20、将各种待测液在对应的各目标酶解温度tj下分别放置反应预设时间tn，形成各种空白对照分析液，各种空白对照分析液与各酶解液一一对应，空白对照分析液经定容、混匀、高速低温离心取上清及对上清过滤处理后采用uplc-hrms联用仪测定得到第一测定值，第一测定值为第二测定值的待扣除背景值，第二测定值经过与空白对照分析液对应的酶解液过滤后所得滤液采用uplc-hrms联用仪测定得到的。
21、在本申请一些可选的实施例中，s14的步骤中，高速低温离心处理包括：
22、将混匀后的各种大曲酶解液在4℃条件下于9000～12000rpm，离心4～10min。
23、在本申请一些可选的实施例中，s15的步骤中，采用0.22μm水相针微孔滤膜过滤第一上清液。
24、在本申请一些可选的实施例中，步骤s20的步骤中，uplc超高效液相色谱分析中选取的色谱柱为hypersil gold(150×2.1mm，1.9μm)超高压液相色谱柱。
25、在本申请一些可选的实施例中，s20的步骤中，uplc超高效液相色谱的分析条件包括：选用hypersil gold c18(150mm×2.1mm，1.9μm)超高压液相色谱柱；柱温为30～50℃，进样量为1～10μl，流速0.2～0.4ml/min，分析时间为10～15min，采用预设梯度洗脱模式，采用1mmol/l乙酸铵-0.1％甲酸水溶液为第一流动相和甲醇为第二流动相。
26、在本申请一些可选的实施例中，柱温为35℃，进样量为5μl，流速0.2ml/min，分析时间为12min。
27、在本申请一些可选的实施例中，预设梯度洗脱模式条件包括：
28、0min对应：流速0.2ml/min，第一流动相的体积分数为80％，第二流动相的体积分数为20％，梯度曲线为5；
29、2.0min对应：流速0.2ml/min，第一流动相的体积分数为80％，第二流动相的体积分数为20％，梯度曲线为5；
30、3.0min对应：流速0.2ml/min，第一流动相的体积分数为40％，第二流动相的体积分数为60％，梯度曲线为5；
31、10.0min对应：流速0.2ml/min，第一流动相的体积分数为100％，第二流动相的体积分数为0％，梯度曲线为5；
32、10.1min对应：流速0.2ml/min，第一流动相的体积分数为100％，第二流动相的体积分数为0％，梯度曲线为5；
33、12.0min对应：流速0.2ml/min，第一流动相的体积分数为100％，第二流动相的体积分数为0％，梯度曲线为5。
34、在本申请一些可选的实施例中，s20的步骤中，hrms高分辨质谱仪的离子源条件为：采用加热电喷雾电离源；鞘气流量为2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述S11的步骤包括：
3.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述S12的步骤，包括：
4.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述S14的步骤中，所述高速低温离心处理包括：
5.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述S15的步骤中，采用0.22μm水相针微孔滤膜过滤所述第一上清液。
6.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述步骤S20的步骤中，UPLC超高效液相色谱分析中选取的色谱柱为Hypersil GOLD(150×2.1mm，1.9μm)超高压液相色谱柱。
7.根据权利要求6所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述S20的步骤中，UPLC超高效液相色谱的分析条件包括：选用HypersilGold C18(150mm×2.1mm，1.9μm)超高压液相
8.根据权利要求1或7所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述S20的步骤中，HRMS高分辨质谱仪的离子源条件为：采用加热电喷雾电离源；鞘气流量为20～50arb；辅助气流量为5～20arb；喷雾电压为-2.8～-3.2kV；离子源温度为250～350℃；毛细管温度为300～320℃；
9.根据权利要求8所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述S20的步骤中，HRMS高分辨质谱仪的扫描条件为：
10.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述多种生物酶包括果胶酶、单宁酶、蛋白酶、糖化酶及液化酶，
11.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述S20的步骤包括：
...【技术特征摘要】
1.大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述s11的步骤包括：
3.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述s12的步骤，包括：
4.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述s14的步骤中，所述高速低温离心处理包括：
5.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述s15的步骤中，采用0.22μm水相针微孔滤膜过滤所述第一上清液。
6.根据权利要求1所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述步骤s20的步骤中，uplc超高效液相色谱分析中选取的色谱柱为hypersil gold(150×2.1mm，1.9μm)超高压液相色谱柱。
7.根据权利要求6所述的大曲中多种生物酶活性的检测方法，其特征在于，所述s20的步骤中，uplc超高效液相色谱的分析条件包括：选用hypersilgold c18(1...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪地强，杨军林，杨少娟，尹延顺，尤小龙，吴成，谢丹，范恩帝，朱安然，赵雯宇，黄河鸥，
申请(专利权)人：贵州习酒股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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