【技术实现步骤摘要】
本申请属于分子生物学，更具体地说，是涉及一种cot dna及其制备方法和应用。
技术介绍
1、在核酸复性研究中，定义了一个cot的术语，cot值等于浓度(co，单位为摩尔)乘以时间(t，单位为秒)；在分子生物学研究中，cot值通常用于分析dna的复杂性、重复序列的丰度以及核酸杂交实验的优化。cot dna常用于封闭重复dna序列，从而达到降低非特异性杂交的目的；在ngs液相捕获、原位杂交、微阵列杂交、滤膜杂交等实验中应用广泛。人cot dna还是体细胞杂交文库和流式分选染色体文库的有效文库筛选探针。
2、目前制备cot dna的方法主要包括以下步骤：1.先将基因组dna打断为100-1000bp大小的片段；2.将打断后的dna片段进行纯化回收；3.将纯化后的片段经过变性、退火；4.去除退火后的单链dna片段；5.纯化回收剩余的双链dna片段，得到cot dna。
3、现有制备cot dna的流程较长，由于核酸外切酶的消化作用导致最终产物的得率不高。此外，由于打断后的片段平均大小不一，退火时间是一定的，所以导致最终cot dna中重复序列的含量只能达到90％-95％左右。
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种cot dna及其制备方法和应用，通过crispr/cas9技术对基因组dna进行双链dna的打断，特异性的获取50-300bp大小的重复序列；免去了打断、变性、退火和消化等流程，缩短了实验时间，增大了cot dna的产量，同时提高了cot dna中
2、为实现上述目的，本申请的第一方面，提供了一种cot dna的制备方法，包括以下步骤：
3、s1、获取物种基因组dna；
4、s2、针对所述基因组dna的重复序列设计sgrna；
5、s3、利用所述sgrna，通过crispr/cas9技术对所述基因组dna的重复序列进行特异性的切割，得到产物；
6、s4、将所述产物进行纯化，得到cot dna。
7、进一步地，所述sgrna靶序列符合5’-n(20)ngg-3’的序列排列规则，其中n(20)表示20个连续的碱基，其中每个n表示a或t或c或g，符合所述规则的靶序列位于正义链或反义链。
8、进一步地，所述步骤s3中，切割后得到的所述产物中含有50-300bp大小的重复序列；和/或所述步骤s4中通过磁珠纯化。
9、进一步地，所述步骤s3中进行特异性切割所配制的反应体系中含有：所述基因组dna、所述sgrna、无酶水和cas9蛋白，所述反应体系在37℃反应60min。
10、进一步地，所述基因组dna为人基因组中alu和kpn基因；所述sgrna靶序列为序列表中seq id no：1～50所示。
11、本申请的第二方面，提供了一种cot dna，采用上述任一项所述的制备方法得到。
12、本申请的第三方面，提供了一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒，包括上述所述的cot dna。
13、本申请的第四方面，提供了一种cot dna在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。
14、本申请的第五方面，提供了一种核酸杂交的方法，包括使用上述所述的cot dna进行封闭的步骤。
15、本申请的第六方面，提供了一种序列捕获的方法，包括使用上述所述的cot dna进行封闭的步骤。
16、与现有技术相比，本申请具有以下的技术效果：
17、本申请的一种cot dna的制备方法相比于目前常用的cot dna制备方法，减少了打断、变性、退火和消化等实验流程，可更快速地制备出cot dna，提高制备效率，且本申请的一种cot dna的制备方法避免了常用方法中核酸外切酶的非特异性消化步骤，可以使制备出的cot dna的产量提高20％左右。
18、本申请的一种cot dna的制备方法利用sgrna，通过crispr/cas9技术对基因组dna的重复序列进行特异性的切割，可以特异性切割重复序列的位点，使制备的cot dna中重复序列的含量更高。
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1.一种cot DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种cot DNA的制备方法，其特征在于，所述sgRNA靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合所述规则的靶序列位于正义链或反义链。
3.如权利要求1所述的一种cot DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，切割后得到的所述产物中含有50-300bp大小的重复序列；和/或所述步骤S4中通过磁珠纯化。
4.如权利要求1所述的一种cot DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中进行特异性切割所配制的反应体系中含有：所述基因组DNA、所述sgRNA、无酶水和Cas9蛋白，所述反应体系在37℃反应60min。
5.如权利要求2所述的一种cot DNA的制备方法，其特征在于，所述基因组DNA为人基因组中Alu和Kpn基因；所述sgRNA靶序列为序列表中SEQ ID NO：1～50所示。
6.一种cot DNA，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的制备
7.一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的cotDNA。
8.如权利要求6所述的一种cot DNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。
9.一种核酸杂交的方法，其特征在于，包括使用权利要求6所述的cot DNA进行封闭的步骤。
10.一种序列捕获的方法，其特征在于，包括使用权利要求6所述的cot DNA进行封闭的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种cot dna的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种cot dna的制备方法，其特征在于，所述sgrna靶序列符合5’-n(20)ngg-3’的序列排列规则，其中n(20)表示20个连续的碱基，其中每个n表示a或t或c或g，符合所述规则的靶序列位于正义链或反义链。
3.如权利要求1所述的一种cot dna的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，切割后得到的所述产物中含有50-300bp大小的重复序列；和/或所述步骤s4中通过磁珠纯化。
4.如权利要求1所述的一种cot dna的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中进行特异性切割所配制的反应体系中含有：所述基因组dna、所述sgrna、无酶水和cas9蛋白，所述反应体系在37℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：李彬，何彬，周雪，郭琼钰，王蓉，曹现涛，陆亚平，魏启浩，
申请(专利权)人：国药武汉医学实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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