一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供了一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法。该试剂盒为基于MIRA荧光法的乙型流感病毒核酸检测试剂盒。其中，MIRA的引物是根据乙型流感病毒的特异病毒核蛋白(NP)保守序列设计的，本发明专利技术提供了一种快速、特异、灵敏、无需复杂仪器设备的核酸检测试剂盒及其使用方法。试剂盒及其使用方法。试剂盒及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术属于分子诊断生物学
，涉及一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]乙型流行性感冒(流感)病毒(B.parapertussis)是引起流感疾病发生和流行的主要病原之一，至今为止发现只有一个亚型，宿主特异性较强，至今发现其只能感染人和海豹，一般不引起世界范围内的大流行，但是它能够引起地区性、季节性的流行。其引发的症状与其他呼吸道传染疾病难以准确区分，需要实验室检测以支持后续工作。因此，准确鉴定和区分乙型流感病毒和其他病毒的种类对于确定和优化治疗方案以及抑制病原菌的传播具有重要意义。
[0003]近年来，分子生物学方法不断被应用到呼吸道病原体的快速检测中，呼吸道病原体的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了呼吸道病原体实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。
[0004]MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification)技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术，基本原理是：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D
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loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3
’
末端，开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增。荧光检测则依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。MIRA技术具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被应用于多种重要疾病病原体的检测中。
[0005]针对现有技术中存在的问题，本专利技术研发并评估了多酶快速恒温扩增荧光MIRA法作为乙型流感病毒核酸检测的试剂盒。

技术实现思路

[0006]因此，本专利技术为了解决上述技术问题中的至少一个，提供了一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法，该试剂盒能够节约反应时间，反应温度要求低。
[0007]根据本公开的第一方面，提供了一种引物组合，用于扩增包括乙型流感病毒基因序列的扩增片段，其特征在于，包括第一引物和第二引物，其中，
[0008]所述第一引物的序列为：
[0009]CTAACCCTGCTTGCTCGTAGTATGGTCGTT；
[0010]所述第二引物的序列为：
[0011]CATTGGAGCCCAAAACTGGAGCTTGATGGA。
[0012]在一些可能的实现方式中，还包括第三引物，所述第三引物的序列为：
[0013]AGTAGTGCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAATACCTCAACTAGGGTTCA。
[0014]根据本公开的第二方面，提供了一种探针组合，用于乙型流感病毒的核酸检测，其特征在于，包括所述第一引物、第二引物和荧光探针；所述荧光探针为经过位点修饰后的所述第三引物。
[0015]在一些可能的实现方式中，所述荧光探针序列为：
[0016]AGTAGTGCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAA/iHEXdT/A/idSp/C/iBHQ1dT/CAACTAGGGTTCA C3spacer。
[0017]根据本公开的第三方面，提供了一种试剂盒，用于乙型流感病毒的核酸检测，其特征在于，包括扩增反应试剂，所述扩增反应试剂中包括如权利要求3所述的探针组合。
[0018]在一些可能的实现方式中，还包括缓冲液、阳性质控品和阴性质控品。
[0019]在一些可能的实现方式中，所述阳性质控品为乙型流感病毒的分离培养物。
[0020]在一些可能的实现方式中，所述阴性质控品为生理盐水。
[0021]根据本公开的第四方面，提供了一种前述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0022]提取待测样本的核酸；
[0023]配制反应体系，向所述反应体系中加入所述核酸，进行MIRA扩增反应；
[0024]根据是否出现相应扩增曲线，分析待测样本中是否含有乙型流感病毒。
[0025]在一些可能的实现方式中，MIRA扩增反应在温度设定为42℃的荧光检测器中进行。
[0026]在一些可能的实现方式中，所述试剂盒用于口咽拭子、鼻咽拭子核酸检测。
[0027]通过以上的技术方案可知，本专利技术具有优势如下：
[0028]能够节约反应时间，降低反应温度。具体地，MIRA反应只需要5～20min，加上样品处理以及准备时间，整个检测过程能够在1h之内完成，而且与常规PCR相比，不经过变温过程，逆转录和扩增同时进行，只需要在恒温42℃即可反应。
[0029]扩增所需的酶和引物探针等冻干成粉，能够在常温下保存。
[0030]操作更加简单、便携：无需配制检测试剂，仅需加样一次，即可上机检测出结果，不需要熟练的专业人员操作。
[0031]特异性强、灵敏度高，检测结果真实可靠。
[0032]在扩增反应试剂的Abuffer中添加了核酸外切酶III，切割扩增产物，降低产物污染的可能性。
附图说明
[0033]为了更清楚地说明本专利技术实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0034]图1为MIRA荧光法检测乙型流感病毒的灵敏度示意图；
[0035]图2为MIRA荧光法检测乙型流感病毒的特异性示意图。
具体实施方式
[0036]为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施方式中的附图，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。因此，以下对在附图中提供的本专利技术的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本专利技术的范围，而是仅仅表示本专利技术的选定实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。
[0037]荧光MIRA引物、探针的设计
[0038]根据乙型流感病毒NP基因序列，采用DNAMAN软件比对找出特异区域，以特异序列为模板，根据MIRA扩增反应原理进行引物、探针的设计。
[0039]本实施例中使用的引物组合和探针序列如表1所示：
[0040]表1 引物与探针序列
[0041][0042]其中，第一引物为MIRA
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F2、第二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组合，用于扩增包括乙型流感病毒基因序列的扩增片段，其特征在于，包括第一引物和第二引物，其中，所述第一引物的序列为：CTAACCCTGCTTGCTCGTAGTATGGTCGTT；所述第二引物的序列为：CATTGGAGCCCAAAACTGGAGCTTGATGGA。2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，还包括第三引物，所述第三引物的序列为：AGTAGTGCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAATACCTCAACTAGGGTTCA。3.一种探针组合，用于乙型流感病毒的核酸检测，其特征在于，包括所述第一引物、第二引物和荧光探针；所述荧光探针为经过位点修饰后的所述第三引物。4.如权利要求3所述的探针组合，其特征在于，所述荧光探针序列为：AGTAGTGCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAA/iHEXdT/A/idSp/C/iBHQ1dT/CAACTAGGGTTCA C3sp...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹现涛，陆亚平，李拼，李彬，魏光，
申请(专利权)人：国药武汉医学实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：