一种用于快速鉴别新型冠状病毒的引物组、探针以及试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术属于病毒株鉴别方法技术领域，具体涉及一种用于快速鉴别新型冠状病毒的引物组、探针以及试剂盒和检测方法，所述引物组和探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，所述下游引物核苷酸序列的5

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速鉴别新型冠状病毒的引物组、探针以及试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于病毒株鉴别方法
，具体涉及一种用于快速鉴别新型冠状病毒的引物组、探针以及试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒肺炎(COVID-19,NCP)是由新型冠状病毒病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV-2)引起的肺炎，临床表现以发热、乏力、干咳为主要特征，鼻塞、流涕等上呼吸道症状较为少见，呼吸道飞沫和密切接触传播是该病主要的传播途径，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下中存在经气溶胶传播的可能。基于目前的流行病学调查，该病潜伏期为1～14天，多为3～7天，以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状。重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍，值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。
[0003]NCP的肆虐严重威胁人类健康,给经济、社会带来了沉重的负担和严峻的挑战,与之相应的病毒溯源、传播机制和防控策略等方面的研究成为重大需求。
[0004]目前，对于疑似病例的诊断，主要通过两种方法进行检测：第一种方法是通过呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；第二种方法是通过呼吸道标本或血液标本病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；具备以上病原学证据之一者为确诊病例。
[0005]而这两种检测方法过程均较为繁琐，需要找到一种快速简便的检测方法鉴别SARS-CoV-2，RPA-LFD技术作为一种快速简便的检测方法在禽流感病毒、动物A型流感病毒以及鸡传染性喉气管炎等病毒的鉴别方面已有较为广泛的应用。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)主要依赖于三种酶：重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白和DNA聚合酶，整个RPA反应过程进行非常快，一般在恒定37℃反应20分钟即可扩增大量目的产物。RPA反应产物可通过测流免疫试纸条(LFD)进行快速检测，RPA-LFD技术具有特异性强、操作过程简单、无初始加热步骤、灵敏度高、检测快速等优点。
[0006]申请人中国人民解放军疾病预防控制中心于2019年8月20日提出了专利技术专利申请201910769954.1，公开了一种用于呼吸道病毒检测的RPA引物、探针组以及试剂盒，属于病毒检测
，所述呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7；该专利技术所述引物、探针组具有特异性好、灵敏度高的优点，能够用于现场快速检测呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63、腺病毒7型。
[0007]申请人中国农业科学院兰州兽医研究所于2019年7月29日提出了专利技术专利申请201910688530.2，公开了一种猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组及试剂盒，该专利技术提供的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针；所述下游引物的核苷酸序列5
’
端
修饰有生物素的物质，所述探针的核苷酸序列的3
’
端修饰C3Spacer，5
’
端修饰荧光素、5
’
端起第30位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。该专利技术所述引物探针组能够快速检测猪德尔塔冠状病毒，简单、灵敏性高、和特异性强，能够提高当前控制PDCoV方案的有效性。
[0008]以上两个专利技术专利申请分别公开了RPA技术检测冠状病毒NL63和LFD-RPA技术检测猪德尔塔冠状病毒的引物探针组和试剂盒，但均未提到本专利技术中涉及的新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测引物探针组和试剂盒。
[0009]所以，本专利技术要解决的技术问题是：如何构建一种用于快速鉴别新型冠状病毒的引物组、探针以及试剂盒和检测方法。

技术实现思路

[0010]本专利技术目的在于提供一种用于快速鉴别新型冠状病毒的引物组和探针，所述引物组包括上游引物和5
’
端带有生物素的下游引物，所述探针的核苷酸序列的5
’
端带有羧基荧光素、3
’
端带有C3-spacer基团，所述引物组和探针特异性强、灵敏度高。
[0011]本专利技术的又一目的在于提供一种用于快速鉴别新型冠状病毒的RPA试纸条试剂盒。
[0012]本专利技术的再一目的在于提供一种用于快速鉴别新型冠状病毒的RPA-LFD检测方法，该方法特异性强、操作过程简单、无初始加热步骤、灵敏度高，可以在更短的时间内，准确的检测出SARS-CoV-2。
[0013]本专利技术的技术方案为：
[0014]一种用于快速鉴别新型冠状病毒的引物组和探针，所述引物组和探针的核苷酸序列如下所示：
[0015]上游引物SARS-CoV-2-F1：5
’
AGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAA 3
’
(SEQ ID NO：1)；
[0016]下游引物SARS-CoV-2-R1：5
’
Biotin-TTCGCACTAGAATAAACTCTGAACTCACTT 3
’
(SEQ ID NO：2)；
[0017]荧光探针SARS-CoV-2-P1：5
’
[FAM]TTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAAT[THF]GGTACTAAGAGGTTT[C3-spacer]3
’
(SEQ ID NO：3)；
[0018]其中，biotin表示生物素，FAM表示羧基荧光素，THF表示四氢呋喃连接子，C3-spacer指的是3个亚甲基，用于阻止链的延伸。
[0019]一种快速鉴别新型冠状病毒的RPA试纸条试剂盒，所述试剂盒包含上述引物组和探针。
[0020]进一步地，所述试剂盒还包含阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为包含新型冠状病毒SARS-CoV-2的S基因的质粒DNA；所述阴性对照品为去离子水。
[0021]进一步地，所述试剂盒还包含RNA提取试剂、反转录试剂、RPA扩增试剂和侧向流动试纸条。
[0022]进一步地，所述试剂盒还包含醋酸镁、ddH2O、5
×
Extration Buffer。
[0023]一种利用上述引物组和探针快速鉴别新型冠状病毒的RPA-LFD检测方法，包括如下步骤：
[0024](1)提取待测样品RNA；
[0025](2)将步骤(1)中的RNA反转成cDNA；
[0026](3)以步骤(2)中的cDNA为模板，用所述引物组和探针对样品进行RPA扩增反应，获得扩增产物A1；
[0027](4)将扩增产物A1与5
×
Extration Buffer反应，获得产物B1；
[0028](5)将产物B1滴加至侧向流动试纸条的加样孔，进行LFD反应，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于快速鉴别新型冠状病毒的引物组和探针，其特征在于，所述引物组和探针的核苷酸序列如下所示：上游引物SARS-CoV-2-F1：5
’
AGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAA3
’
(SEQ ID NO：1)；下游引物SARS-CoV-2-R1：5
’
Biotin-TTCGCACTAGAATAAACTCTGAACTCACTT 3
’
(SEQ ID NO：2)；荧光探针SARS-CoV-2-P1：5
’
[FAM]TTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAAT[THF]GGTACTAAGAGGTTT[C3-spacer]3
’
(SEQ ID NO：3)。2.一种快速鉴别新型冠状病毒的RPA试纸条试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1中所述的引物组和探针。3.根据权利要求2所述的一种快速鉴别新型冠状病毒的RPA试纸条试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含RNA提取试剂、反转录试剂、RPA扩增试剂和侧向流动试纸条。4.根据权利要求2所述的一种快速鉴别新型冠状病毒的RPA试纸条试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含醋酸镁、ddH2O、5
×
Extration Buffer。5.一种利用权利要求1引物组和探针快速鉴别新型冠状病毒的RPA-LFD检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测样品RNA；(2)将步骤(1)中的RNA反转成cDNA；(3)以步骤(2)中的cDNA为模板，用所述引物组和探针对样品进行RPA扩增反应，获得扩增产物A1；(4)将扩增产物A1与5

【专利技术属性】
技术研发人员：沈永义，陈晓媛，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：