检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用制造技术

本发明专利技术属于非洲猪瘟病毒检测领域，提供了检测具有感染性ASFV的EMA

【技术实现步骤摘要】
检测具有感染性ASFV的EMA
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ddPCR引物、探针及应用


[0001]本专利技术涉及ASFV核酸检测领域，更具体地，涉及检测具有感染性ASFV的EMA
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ddPCR 引物、探针及应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus， ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病率和死亡率可达100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。1921年， ASF最初发现于肯尼亚，上世纪五、六十年代在非洲、欧洲、南美洲流行。由于ASFV感染机制复杂，目前世界范围内至今尚无有效预防用非洲猪瘟疫苗，采取严格的生物安全措施清除猪场内已存在的ASFV及阻止病毒与猪的接触是目前防控ASF唯一有效的途径。因此及时发现、精准检测是控制该病传播和发生的关键。
[0003]当前，对ASFV的核酸检测手段主要是qPCR法，该方法以其较高的特异性及敏感性在 ASFV检测方面发挥着重大作用。但该方法只能检测样本中是否存在病毒的核酸序列，对于样本中的病毒是否具有衣壳蛋白完整性和感染性等均不能给出有效提示。研究报道了大量在猪场生产区、生活区、办公区、环境等场所及饲料中出现ASFV核酸阳性事件。更加细致的研究发现，这些核酸检测阳性有很多是由于这些场所已进行高温、消毒剂等灭活措施而产生的“假阳性”。经相关研究，猪接触不具备感染性但核酸阳性的ASFV样本，并不会引起其感染ASFV。但是，大家对ASFV核酸阳性产品避之不及，唯恐产品中含ASFV，核酸阳性结果势必造成一定的恐慌。同时，假阳性事件严重影响猪场复养前风险评估、日常生物安全监控等结果数据的真实性，延缓本已具备复养条件养殖场的复养时间，影响养殖收益和效率。因此，感染性ASFV的检测十分重要。现阶段，感染性ASFV检测通常包括病毒分离和红细胞吸附试验(Hemoadsorption test，HAD)。但是目前国内仅有少数机构实验室具有开展 ASFV活病毒实验的资质，多数实验室无法进行，这使得活病毒检测实施困难。病毒分离和 HAD测定需要消耗珍贵的仔猪原代骨髓细胞或肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophage， PAM)，也只能检测到具有红细胞吸附特性的ASFV毒株，红细胞吸附试验一般需要7
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15 天，耗时较长。因此，迫切需要开发一种检测感染性ASFV快速简便，准确性、灵敏度高的替代技术。
[0004]叠氮溴化乙锭(EMA)是一种对DNA具有高度亲和力的光敏核酸染料，EMA不能穿透完整的病毒衣壳蛋白，只能选择性地结合病毒衣壳蛋白受损后所暴露出来的核酸。病毒衣壳蛋白的完整性是判断病毒活性的一个标志，猪场复养前终末消除、日常消毒处理大多使用高温灭活或化学消毒剂灭活等方式进行消毒杀菌，这些灭活方法及化学制剂主要通过破坏病毒衣壳蛋白结构的方式使病毒失活。EMA能够穿透受损的病毒衣壳蛋白与病毒核酸结合，在一定条件下孵育、光解后，EMA会和暴露的核酸稳定交联使核酸无法进行后续的PCR反应，从而去除失活病毒暴露的核酸所引起的干扰(假阳性)，达到检测样本中是否含有感染性病毒的目的。EMA
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qPCR已在检测食品、环境、水等样品中感染性细菌及病毒中得到了良好的应用。EMA抑制衣壳蛋白受损病毒PCR扩增的效率除与EMA孵育条件、孵育温度、光解时间
等有关，还与扩增目的片段的长度、靶基因的位置有关。EMA进入衣壳蛋白受损的病毒中时，会以一定的化学计量比与病毒核酸结合，理论上靶基因受到EMA修饰即可抑制目的片段PCR的扩增，因此较长的目的基因扩增片段会提高与EMA结合的概率，从而提高EMA抑制效果，然而较长的扩增片段可能会降低PCR反应的扩增效率以及灵敏度。另外，病毒基因组中不同区域、不同位置由于其GC含量、碱基偏好、构象特征不同，其与 EMA结合效率也不同。在沙门氏菌EMA抑制死细菌效果试验中，选择了相同长度但不同位置的目的基因片段，获得了不同的EMA抑制效果。因此，平衡好目的片段长度与EMA 抑制效率、筛选出ASFV基因组中较为合适的EMA结合区域对于检测感染性ASFV技术方法的研发至关重要。微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)是第三代PCR(PolymeraseChain Reaction，聚合酶链式反应)技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的方法。其基本原理是将核酸稀释并平均分配到无数个独立的反应单元中，对反应单元中的PCR体系进行 PCR扩增，然后通过PCR终点信号“有或无”来实现不依赖于标准曲线的单分子绝对定量。 ddPCR具有高灵敏度、绝对定量、抗干扰性强的优势。因此，检测感染性ASFV的EMA
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ddPCR 引物和探针及检测方法的建立，不仅能选择性的区分ASFV的感染性，还能对样品中的ASFV 进行快速、准确的定量检测，为ASFV核酸检测开辟新的


技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供了一种检测基于EMA
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ddPCR的方法的靶点序列的试剂在制备区分非洲猪瘟病毒核酸阳性与病毒阳性的试剂盒中的应用，所述的靶点序列为SEQ IDNO.94所示。
[0006]本专利技术的另一个目的在于提供了基于EMA
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ddPCR的方法设计的引物和探针在制备区分非洲猪瘟病毒核酸阳性与病毒阳性的试剂盒中的应用，所述的引物为：F：CATTGCCTA TGCCATCCATG和R：ACGCAAAGTCGAGACCT，探针为P：ACCTCGGGCAATGGTAC TGCAAG。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0008]本专利技术的目的在于提供了一种检测基于EMA
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ddPCR的方法的靶点序列的试剂在制备区分非洲猪瘟病毒核酸阳性与病毒阳性的试剂盒中的应用，所述的靶点序列为SEQ IDNO.94所示。
[0009]以上所述的应用中，优选的，所述的基于EMA
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ddPCR的方法的靶点序列的试剂为引物和探针，引物为：F：CATTGCCTATGCCATCCATG和R：ACGCAAAGTCGAGACCT，探针为P：ACCTCGGGCAATGGTACTGCAAG，探针携带有本领域的常规荧光基团。
[0010]以上所述的应用中，优选的，所述试剂盒在应用过程中的体系为：
[0011]2×
SuperMix 15μL、上下游引物终浓度各800pM、探针终浓度400pM、DNA模板4μL， ddH2O补足至30μL；
[0012]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0013]本专利技术所提供的检测ASFV的ddPCR引物和探针可以很好的区分非洲猪瘟病毒核酸阳性与病毒阳性，同时具有灵敏度高、重复性好的特点。将该引物探针及检测方法应用于检测感染性ASFVddPCR试剂盒，在2
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测基于EMA
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ddPCR的方法的靶点序列的试剂在制备区分非洲猪瘟病毒核酸阳性与病毒阳性的试剂盒中的应用，所述的靶点序列为SEQ ID NO.94所示。2.根据权利要求1所述的应用，所述的基于EMA
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ddPCR的方法的靶点序列的试剂为引物和探针，引物为：F：CATTGCCTATGCCATCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，高朔，邹维华，吕长杰，邹忠，杨丽，孙小美，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：