【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于生物工程及其应用，具体涉及一种新型果胶特异性结合蛋白及其制备与应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、果胶是一类结构复杂的天然多糖，是高等植物细胞壁的重要组成部分，与纤维素、半纤维素共同构成植物细胞初生壁和胞间层。根据其单糖组成及分子结构的差异，可分为同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，hg)、i型鼠李半乳糖醛酸聚糖(type irhamngalacturonan，rg-i)及ii型鼠李半乳糖醛酸聚糖(type ii rhamngalacturonan，rg-ii)等类型。其复杂的结构使得其具有多样的生物活性，如免疫调节作用、抗肿瘤、降血糖、改善胃肠道等。同时，果胶也可作为天然的多功能型食品添加剂，被用作凝胶剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂等，在食品工业、医药保健品、化工、纺织及化妆品等领域得到了广泛的应用并具有良好的发展前景。
2、碳水化合物特异性结合蛋白是碳水化合物活性酶中天然存在的底物结合模块，是组成酶的一种结构与功能独立的结构域，具有精准的多糖结合能力。糖类物质的免疫原性弱、以动物免疫制备抗体的难度大，而碳水化合物特异性结合蛋白具有分子尺寸小、获取高效、标记灵活等优势，是碳水化合物定性、定量、定位等特异性检测分析的重要工具。随着碳水化合物酶的深入研究，新型的碳水化合物特异性结合蛋白也不断被发现。发掘新型的果胶特异性结合蛋白，并选择性能优良的结合蛋白作为果胶研究与开发的新颖工具，具有实际意义。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术要解决的技术问题是碳水化合物特异性结合蛋白具有分子尺寸小、获取高效、标记灵活等优势，是碳水化合物定性、定量、定位等特异性检测分析的重要工具。而目前仍有大量存在于酶中的序列新颖、未知功能的结构域未被解析，其中也包括潜在的碳水化合物特异性结合蛋白。
2、为解决上述问题，本专利技术发现一段蛋白序列可以结合果胶，而不与其他碳水化合物结合，具备特异性结合的能力，并进一步的利用该特异性结合蛋白实现了果胶的检测，展现了该特异性结合蛋白的良好应用潜力。
3、为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现，特异性结合果胶的结合蛋白，命名为pecbp_lp，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、seq id no.1：
5、atttthelnvsnsmtvgqyssdftlngftfitggsiwevdsssrsyggvnftqrvksggkgtiskraisftasgagqltvyamssgstsrnvtlygngkdlesftavqdvitamnftipnsgtyviyppddgisyyylkvvktdstptptptvkptqtptptpt
6、与把合成的蛋白质送出胞外，不参与物质结合的信号肽不同，本专利技术所述的果胶特异性结合蛋白pecbp_lp能够特异性结合苹果来源果胶(hg)(商业化试剂标准品，4mg/ml)、柑橘皮来源果胶(hg)、土豆来源果胶(rg-i)，而对纤维素、木聚糖、β-葡聚糖等植物中存在的其他多糖及褐藻胶、糖胺聚糖等含有糖醛酸结构的多糖均不具有结合能力(图1所示)，具备高度的特异性。本专利技术中的pecbp_lp制备简便、成本低，同时能够大批量获取，易用于果胶的特异性检测。
7、编码上述果胶特异性结合蛋白pecbp_lp所对应的核苷酸序列如seq id no.2所示，及可翻译出seq id no.1的所有基因。
8、seq id no.2：
9、gcaacgacgacaacacatgaattaaatgtatcaaattcaatgacagtaggacaatactcatcagattttactttaaatggatttacatttattacaggaggatctatatgggaagtagatagctctagccggtcttacggtggtgtaaactttacgcagagagttaaatcgggcggaaagggtaccattagtaaaagagcaatctcatttacagcttctggagcaggtcaattaacagtttatgcaatgagttctggaagtacttcaagaaatgtaacgctttatgggaacggtaaggatctagaaagctttactgcagtgcaagatgtcattactgctatgaattttacgattccaaattccggtacttatgttatttatccaccagacgatggtattagctactactatttaaaggtagttaaaaccgactcaacacctacaccaactccaacagtaaaaccgacccaaacacctacaccaactccaact
10、本专利技术提供了特异性结合果胶的结合蛋白pecbp_lp，基于pecbp_lp明确的基因序列，通过克隆表达的方法制备出特异性结合果胶的结合蛋白pecbp_lp。表达宿主为但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等中的任意一种。包括以下及同等作用步骤：
11、(1)依据目的基因、表达载体、酶切位点设计引物，经聚合酶链式反应(pcr)得到目的基因片段pecbp_lp，pcr反应条件为95℃3min，95℃30s，52℃30s，72℃60s，循环25次。
12、(2)利用限制性内切酶双酶切目的基因及载体，连接构成重组质粒，而后将其转入感受态细胞构成重组菌株。其中，限制性内切酶和感受态细胞的选择需分别根据所选表达载体和表达宿主而定。
13、(3)菌株培养、蛋白表达及获取，该步骤所使用的条件根据不同的表达宿主而选择。
14、本专利技术还提供了一种基于特异性结合果胶的结合蛋白pecbp_lp对果胶进行检测的方法。基于特异性结合果胶的结合蛋白，结合微阵列技术能够实现果胶的检测。
15、对于多糖，碳水化合物活性酶的主要作用是把多糖降解，降低多糖的分子量，产生活性寡糖，在检测过程中，可以通过加酶判断有没有特征寡糖的产生，但其流程复杂，无法通过融合荧光探针实现原位分析，具有很大的局限性。结合蛋白是可以直接与多糖特异性结合，无需降解多糖，不会影响多糖分子量，能够实现原位分析。特别是糖类物质的免疫原性弱、以动物免疫制备抗体的难度大，而碳水化合物特异性结合蛋白具有分子尺寸小、获取高效、标记灵活等优势，是碳水化合物特异性检测分析的重要工具。随着碳水化合物酶的深入研究，其中的序列新颖、未知功能的结构域也不断被发现，其中也包括潜在的碳水化合物特异性结合蛋白。
16、其中第一种检测方法包括以下及同等作用步骤：
17、(1)取1μl待测样品至反应介质(硝酸纤维素膜，以下反应介质均指硝酸纤维素膜)上，室温干燥，使待测样品充分与反应介质结合。
18、(2)用含有封闭剂(脱脂奶粉)的缓冲液(磷酸盐缓冲液)封闭反应介质30-90min，避免非特异性结合干扰实验结果。
19、(3)取一定量果胶特异性结合蛋白pecbp_lp均匀滴加至反应介质上(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.特异性结合果胶的结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述结合蛋白所对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，及可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。
3.权利要求1所述结合蛋白的制备方法，其特征在于：基于特异性结合蛋白的基因序列，通过克隆表达的方法制备出特异性结合果胶的结合蛋白。
4.权利要求1的结合蛋白在果胶的检测、半定量分析及可视化观察中的应用。
5.基于权利要求1的结合蛋白对果胶进行检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
6.基于权利要求1的结合蛋白对果胶进行半定量分析的方法，其特征在于包括以下步骤：
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述缓冲液的pH值为5～10。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：缓冲液按体积比1：50000-1：5000的比例稀释抗体。
9.基于权利要求1的结合蛋白对果胶进行特异性可视化观察的方法，其特征在于：染色时在样品中滴加荧光标记与荧光蛋白融合表达的权利要求1所述的特异性结合果胶的结合蛋
10.如权利要求9所述的特异性可视化观察，其特征在于包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.特异性结合果胶的结合蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.编码权利要求1所述结合蛋白所对应的核苷酸序列如seq id no.2所示，及可翻译出seq id no.1的所有基因。
3.权利要求1所述结合蛋白的制备方法，其特征在于：基于特异性结合蛋白的基因序列，通过克隆表达的方法制备出特异性结合果胶的结合蛋白。
4.权利要求1的结合蛋白在果胶的检测、半定量分析及可视化观察中的应用。
5.基于权利要求1的结合蛋白对果胶进行检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
6.基于权利要求1的...
【专利技术属性】
技术研发人员：常耀光，刘冠辰，梅轩玮，薛长湖，张玉莹，陈广宁，孙孟辉，刘开梦，王玉明，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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