【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶催化，涉及udp-糖基转移酶及其在制备高纯度莱鲍迪苷m中的应用。
技术介绍
1、由于高热量糖类的过量摄入导致世界范围内严重的过度肥胖、糖尿病、高血压和心脑血管等疾病。因此，来自甜叶菊的甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低且安全性高而受到广泛关注。其中，含量较为丰富的甜菊糖、莱鲍迪苷a(reb a)等作为甜味剂已广泛应用于饮料、食品等领域。它们具有相较于蔗糖250-300倍的甜度，但是口感上存在甜味之外的苦后味严重影响它们作为甜味剂的口感。而在甜菊糖苷中含量较少的莱鲍迪苷m(reb m)相较于reb a和甜菊糖具有更高的甜度，并且减少了甜味之外的后苦味，且甜味更快而因此作为甜味剂具有更好的口感，被认为是非常具有潜力的下一代甜味剂。其中，reb m相较于rebd具有更高的商业价值。然而，reb m在甜叶菊干叶中的含量仅为0.4％-0.5％，仅为reb a含量的十分之一左右，这也使得通过传统的叶片提取reb a的方法并不适用于reb m的提取。繁琐且复杂的提取方法使得仅从甜叶菊叶子中提取难以实现规模化生产，也难以满足市场需求。利用生物酶法生产莱鲍迪苷m，是目前国内外甜菊糖厂家重点突破方向。但转化率低，酶活低等一直是阻碍酶催化发现的重要因素，因此有必要继续开发高活力，高转化率的工艺方法。此外莱鲍迪苷m的分离纯化方法几乎没有相关报道，得到高纯度的莱鲍迪苷m仍是一大挑战。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供udp-糖基转移酶及其在制备高纯度莱鲍迪苷m中的应用，尤其提供一种
2、在第一个方面，本专利技术提供一种udp-糖基转移酶2突变体，其是将seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的催化活性提高的蛋白质，所述催化活性可以是催化莱鲍迪苷d生成莱鲍迪苷m的活性。
3、在一些实施方案中，所述突变体在seq id no:2所示的氨基酸序列的如下一个或多个位点具有氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加：第30位、第52位、第174位、第282位、第323位；
4、优选地，所述突变体在seq id no:2所示的氨基酸序列上具有如下一个或多个氨基酸残基的取代：l30i、k52e、r174s、g282s、p323t；
5、更优选地，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8任一所示，seq id no:3是seq id no:2所示的糖基转移酶2的l30i突变体，seq id no:4是seq id no:2所示的糖基转移酶2的k52e突变体，seq id no:5是seq id no:2所示的糖基转移酶2的r174s突变体，seq id no:6是seq idno:2所示的糖基转移酶2的g282s突变体，seq id no:7是seq idno:2所示的糖基转移酶2的p323t突变体，seq id no:8是seq id no:2所示的糖基转移酶2的k52e、r174s、p323t三点组合突变体。
6、本专利技术提供的上述udp-糖基转移酶2突变体可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中表达获得。
7、在一些实施方案中，上述udp-糖基转移酶2突变体是通过将含有其编码基因的重组载体导入大肠杆菌(例如bl21(de3))得到重组工程菌，然后将该重组工程菌进行诱导表达得到udp-糖基转移酶2突变体。
8、在第二个方面，本专利技术提供编码上述任一所述的udp-糖基转移酶2突变体的核酸分子，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
9、在一些实施方案中，上述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：
10、1)具有seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16任一所示的核苷酸序列的核酸分子；
11、2)与1)限定的核酸分子杂交且编码上述任一所述的udp-糖基转移酶2突变体的核酸分子；
12、3)与1)或2)限定的核酸分子具有90％以上的同一性且编码上述任一所述的udp-糖基转移酶2突变体的核酸分子。
13、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。
14、这里使用的术语“同一性”可以用肉眼或计算机软件(比如ausubel et al.eds.(2007)在current protocols in molecular biology中所述的软件程序)进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基或氨基酸相同。
15、在第三个方面，本专利技术提供一种udp-糖基转移酶1，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
16、本专利技术提供的上述udp-糖基转移酶1可以是天然、重组或合成的活性多肽，该活性多肽可以是天然纯化的产物、化学合成的产物，或是使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中产生的产物。
17、在一些实施方案中，上述udp-糖基转移酶1是通过将含有其编码基因的重组载体导入大肠杆菌(例如bl21(de3))得到重组工程菌，然后将该重组工程菌进行诱导表达得到udp-糖基转移酶1。
18、在第四个方面，本专利技术提供编码上述udp-糖基转移酶1的核酸分子。
19、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。
20、在第五个方面，本专利技术提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。
21、所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因，其中构建表达载体时用到的载体可以为pet载体，例如pet-28a(+)。
22、在一些实施方案中，上述重组载体为将编码上述udp-糖基转移酶2突变体或udp-糖基转移酶1的核酸分子替换pet-28a(+)的xbai和bamhi酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
【技术保护点】
1.一种UDP-糖基转移酶2突变体，其是将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的催化活性提高的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的UDP-糖基转移酶2突变体，其特征在于：所述突变体在SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的如下一个或多个位点具有氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加：第30位、第52位、第174位、第282位、第323位；
3.编码权利要求1或2所述的UDP-糖基转移酶2突变体的核酸分子。
4.一种UDP-糖基转移酶1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.编码权利要求4所述的UDP-糖基转移酶1的核酸分子。
6.一种重组载体，其包含权利要求3或5所述的核酸分子。
7.一种重组细胞，其包含权利要求6所述的重组载体。
8.一种UDP-糖基转移酶2突变体或UDP-糖基转移酶1的制备方法，包括以下步骤：
9.权利要求1或2所述的UDP-糖基转移酶2突变体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的UDP-糖基转移酶1
10.一种莱鲍迪苷M的制备及其提纯废液再利用的方法，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种udp-糖基转移酶2突变体，其是将seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的催化活性提高的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的udp-糖基转移酶2突变体，其特征在于：所述突变体在seq idno:2所示的氨基酸序列的如下一个或多个位点具有氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加：第30位、第52位、第174位、第282位、第323位；
3.编码权利要求1或2所述的udp-糖基转移酶2突变体的核酸分子。
4.一种udp-糖基转移酶1，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
5.编码权利要求4所述的udp-糖基转移酶1的核酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈开通，王竞辉，张雅萍，
申请(专利权)人：万华化学四川有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。