提高骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种提高模拟微重力环境下骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力的培养方法，所述方法包括：将稳定传代的骨髓间充质干细胞接种至直径９０～１５０μｍ的塑料微载体上，血清饥饿１０～１５小时后，用预处理培养液预处理１～３小时，然后在模拟微重力环境下用成骨诱导液进行诱导培养１４～２８天；本发明专利技术预处理培养液和成骨诱导液中添加２０μｍｏｌ／Ｌ去甲基化药物５－氮－２－脱氧胞苷，并将调节预处理培养液和成骨诱导液中的ＢＭＰ－２浓度提高到２５０ｎｇ／ｍＬ，有效地达到了在模拟微重力环境下增强骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力和降低向脂肪细胞分化能力的双重目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种促进模拟微重力环境条件下骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化 能力的培养方法。这种方法能有效地逆转模拟微重力环境条件对骨髓间充质干细胞向成骨 细胞分化能力的抑制作用，提高定向分化成骨细胞的能力。
技术介绍
太空的微重力(失重)环境严重造成了宇航员的骨量丢失。长期的太空生活使得 宇航员发生类似于老年性骨质疏松的骨形态变化。目前已发现，这种骨形态变化与骨细胞 发育和功能异常有密切的联系。同时，骨髓腔内成骨细胞生成减少，而脂肪细胞大量增加， 说明其共同祖先骨髓间充质干细胞的分化潜能发生了转向，即向成骨细胞分化的能力降 低，而向脂肪细胞分化能力增强。所以，研究造成这种分化转向的分子机理，寻找关键的细 胞信号分子，并针对关键细胞信号分子采取相应的分子调节技术，以逆转这种微重力生物 学效应，将对预防和治疗宇航员的骨形态变化、乃至老年性骨质疏松，开发新的药物，具有 重要的技术意义和开发价值。由于空间实验环境有限，因此目前许多空间环境生物学效应的实验是采用地基模 拟方法。当前为国内外普遍接受的模拟微重力效应的方法是采用美国航天局(NASA)技术 专利的RWV生物反应器(SyntheconRCCS-4DQ)。该反应器在低速旋转下，其培养器内含有携 带细胞的微载体随着培养液以培养器同样的转速旋转，使得细胞因所受重力矢量的随机变 化而呈悬浮状态，在培养液中进行自由落体运动，达到了模拟微重力效应的目的。本申请专利技术人前期通过上述模拟微重力实验，发现在模拟微重力环境抑制了骨髓 间充质干细胞向成骨细胞分化的能力，提升了向脂肪细胞分化能力。分析造成这种分化转 向的分子机理，确定出成骨细胞和脂肪细胞分化相关细胞分子信号转导途径中的一些激酶 和转录因子的表达和活性水平变化是导致这种分化转向的关键细胞信号分子。这些关键细 胞信号分子中，与成骨细胞分化相关的激酶ERK和转录因子Rimx2的表达水平和活性水平 都降低，而与脂肪细胞分化相关的激酶P38和转录因子PPAR γ的表达水平和活性水平都上 升。由此确定，模拟微重力环境导致骨髓间充质干细胞的这种分化转向是由相关的关键细 胞信号分子表达和活性水平发生变化所致。然而，针对上述模拟微重力环境导致骨髓间充质干细胞分化转向的分子机理以及 关键细胞信号分子，采用相关的小分子化合物以及药物等调节关键细胞信号分子的表达及 活性水平，逆转模拟微重力环境导致的这种分化失调，提高骨髓间充质干细胞向成骨细胞 分化的能力，适当降低向脂肪细胞分化的能力。因此，设计模拟微重力环境下骨髓间充质干 细胞定向诱导分化的培养方法，逆转模拟微重力环境导致的这种分化失调，不但对将来进 行太空环境下的干细胞分化实验研究具有指导意义，同时对今后开发航天员骨形态变化以 及老年性骨质疏松症的预防和治疗药物具有重要的实际应用意义。
技术实现思路
本专利技术基于影响骨髓间充质干细胞分化转向的关键细胞信号分子ERK、P38、Rimx2 和PPAR γ的表达和活性水平，判断4种信号分子的表达水平变化与其基因及其调控区组蛋 白的表观遗传特性改变有关，而2种转录因子如1 2和？ 六1 ^的活性是分别受其上游蛋白 激酶ERK和P38控制的。为此，本专利技术的焦点是通过小分子化合物或相关药物，增强ERK的 活性和Rimx2的表达水平，降低P38的活性而抑制PPAR γ的磷酸化，从而达到提高成骨细 胞特异性基因表达和适当降低脂肪细胞特异性基因表达的目的。本专利技术采用的技术方案是一种提高模拟微重力环境下骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力的培养方法， 所述方法包括将稳定传代(通常为第3代)的骨髓间充质干细胞接种至直径90 150 μ m 的塑料微载体(Synthecon公司，休斯顿，美国)上，血清饥饿10 15小时后，用预处理培 养液预处理1 3小时，然后在模拟微重力环境下用成骨诱导液进行诱导培养14 28天；所述模拟微重力环境是指所述诱导培养在RMV生物反应器中、在16r/min转速条 件下进行。所述血清饥饿是指将骨髓间充质干细胞置于不含血清的DMEM培养液中进行培养。现有已报道的模拟微重力环境下细胞培养和分化方法如下将第3代骨髓间充 质干细胞接种到直径90 150 μ m塑料微载体(Synthecon公司，休斯顿，美国)上，用含 10% FBS的DMEM培养液在低粘附培养板中培养7天后，约89. 4士2. 8%的细胞成功贴附 在塑料微载体上。然后将贴附细胞的塑料微载体装入含有成骨诱导液的RWV生物反应器 (SyntheconRCCS-4DQ, Synthecon公司，休斯顿，美国)中诱导培养14天。该生物反应器以 16转/分的转速转动，致使反应器内贴附细胞的塑料微载体聚集并悬浮，以模拟微重力环 境。同时也将接种贴附细胞的塑料微载体于正常重力(IG)下在100毫米的培养板中诱导， 作为对照。成骨诱导液终浓度组成如下10% (w/v，质量体积百分比，指IOOmL诱导液中含 有IOg胎牛血清)胎牛血清、50nmol/mL地塞米松、lOmmol/L0 -磷酸甘油和50 μ mol/L2_磷 酸化抗坏血酸，溶剂为DMEM培养液。关键细胞信号分子表达和活性调节培养(已报道的方法)接种在塑料微载体上 的细胞在诱导前先血清饥饿12小时，再用含有10_6mOl/LSB203580 (Alexis公司，圣地亚哥， 美国)，100ng/mL骨形态蛋白_2 (BMP-2 ；Peprotech公司，落基山，美国)和20ng/mL成纤维 细胞生长因子_2(FGF2 ;Austral Biologicals公司，圣罗马，美国)的DMEM培养液预处理 2小时。然后在模拟微重力环境下用加有上述浓度的SB203580、BMP-2和FGF2的成骨诱导 液进行诱导。本专利技术预处理培养液和成骨诱导液中添加20 μ mol/L去甲基化药物5_氮_2_脱 氧胞苷(5-aza-CdR ；Sigma公司，上海，中国)，并将调节预处理培养液和成骨诱导液中的 BMP-2浓度提高到250ng/mL。提高BMP-2浓度的依据是最近新发现除了低浓度BMP-2能促 进Smad蛋白与Runx2基因调控区结合外，高浓度BMP-2还能促进Runx2基因调控区组蛋白 乙酰化水平，并结合专利技术人发现模拟微重力环境导致Runx2基因甲基化水平增加以及组 蛋白乙酰化水平降低的结果，设计出提高BMP-2浓度和增加5-aza-CdR的新调节培养方法。本专利技术的有益效果是(1)本专利技术方法采用高浓度的BMP-2处理，提高了 Runx2基因调控区组蛋白H3和 H4的乙酰化水平。(2)本专利技术方法采用添加5-aza-CdR的处理，降低了 Runx2基因甲基化水平。(3)本专利技术方法采用FGF2的处理，提高了蛋白激酶ERK的活性，由此提高了 Runx2 的磷酸化水平。(4)本专利技术方法采用小分子化合物SB203580的处理，抑制了 P38的活性，从而降低 了 PPAR γ的活化水平。(5)本专利技术方法采用BMP-2、FGF2、5-aza-CdR和SB203580的联合处理，有效地达 到了在模拟微重力环境下增强骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力和降低向脂肪细胞 分化能力的双重目的。附图说明图1为模拟微重力环境和正常重力环境下成骨细胞和脂肪细胞分化对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高模拟微重力环境下骨髓间充质肝细胞向成骨细胞分化能力的培养方法，所述方法包括：将稳定传代的骨髓间充质干细胞接种至直径９０～１５０μｍ的塑料微载体上，血清饥饿１０～１５小时后，用预处理培养液预处理１～３小时，然后在模拟微重力环境下用成骨诱导液进行诱导培养１４～２８天；　　所述预处理培养液终浓度组成如下：　　ＳＢ２０３５８０　１μｍｏｌ／Ｌ　　ＢＭＰ－２　２５０ｎｇ／ｍＬ　　ＦＧＦ２　２０ｎｇ／ｍＬ　　５－ａｚａ－ＣｄＲ　２０μｍｏｌ／Ｌ　　溶剂为ＤＭＥＭ培养液；　　所述成骨诱导培养液终浓度组成如下：　　ＳＢ２０３５８０　１μｍｏｌ／Ｌ　　ＢＭＰ－２　２５０ｎｇ／ｍＬ　　ＦＧＦ２　２０ｎｇ／ｍＬ　　５－ａｚａ－ＣｄＲ　２０μｍｏｌ／Ｌ　　胎牛血清　１０％　　地塞米松　５０ｎｍｏｌ／ｍＬ　　β－磷酸甘油　１０ｍｍｏｌ／Ｌ　　２－磷酸化抗坏血酸　５０μｍｏｌ／Ｌ　　溶剂为ＤＭＥＭ培养液。

【技术特征摘要】
一种提高模拟微重力环境下骨髓间充质肝细胞向成骨细胞分化能力的培养方法，所述方法包括将稳定传代的骨髓间充质干细胞接种至直径90～150μm的塑料微载体上，血清饥饿10～15小时后，用预处理培养液预处理1～3小时，然后在模拟微重力环境下用成骨诱导液进行诱导培养14～28天；所述预处理培养液终浓度组成如下SB2035801μmol/LBMP 2 250ng/mLFGF220ng/mL5 aza CdR 20μmol/L溶剂为DMEM培养液；所述成骨诱导培养液终浓度组成如下SB2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金福，石东燕，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]