【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种稳定、高产的靶向整合细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
1、现阶段生物学进入了飞速发展的阶段。随着基因工程、蛋白工程和细胞工程等多个学科的发展，生物技术产业得到了大力的发展，生物制药业也蓬勃兴起。生物医药产业是战略性新兴产业，其在不断的发展中伴随着对产物表达量及表达稳定性的要求的增高，而细胞系构建则是决定产物表达产量及表达稳定性的关键因素。
2、目前药物生产多数采取随机整合方式来构建细胞株，常规耗时至少6个月才有机会得到稳定细胞株。该方法工作量极大，成本极高，拷贝数不稳定，位点不稳定，位点对于细胞生理影响的也具有不确定性等，从而导致细胞状态不稳定，无法有效评估稳定产量与建立稳定生产工艺。这些缺点会导致生产的细胞株传代稳定性不佳，导致生长过程丢失目的基因而失去生产价值。
3、有鉴于此，特提出本申请。
技术实现思路
1、本申请实施例的目的之一包括提供一种核酸，包含该核酸的宿主细胞能够稳定、高产地表达整合入seq id no.1的外源核酸片段。
2、在本申请的第一方面，提供一种核酸，所述核酸包含seq id no.1所示的核酸片段，所述核酸片段内整合有外源核酸片段。
3、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3435-3635个碱基区间内的任意位点；
4、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3440-3624个碱基区间内的任意
5、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3451-3615个碱基区间内的任意位点；
6、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3460-3597个碱基区间内的任意位点；
7、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3470-3580个碱基区间内的任意位点；
8、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3480-3570个碱基区间内的任意位点；
9、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3490-3559个碱基区间内的任意位点；
10、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3505-3546个碱基区间内的任意位点；
11、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3525-3557个碱基区间内的任意位点；
12、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3530-3545个碱基区间内的任意位点；
13、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3531-3540个碱基区间内的任意位点。
14、在本申请的一些实施方式中，所述外源核酸片段包含：重组酶识别的第一重组识别序列和第二重组识别序列，位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的选择标记基因和目标基因，以及调控所述选择标记基因和所述目标基因表达的启动子。
15、在本申请的一些实施方式中，所述重组酶为bxb1整合酶、φc31整合酶、cre重组酶或者flp重组酶。
16、在本申请的一些实施方式中，所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列独立地选自如下序列中的一种或者多种：loxp序列、loxpl3序列、loxp 2l序列、loxfas序列、lox511序列、lox2272序列、lox2372序列、lox5171序列、loxm2序列、lox71序列、lox66序列、frt序列、bxb1 attp序列、bxb1 attb序列、attp序列和attb序列。
17、在本申请的一些实施方式中，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因和荧光蛋白基因中的一种或者多种。
18、在本申请的一些实施方式中，所述启动子为cmv启动子、sv40启动子、rsv启动子、β-globin启动子、ubc启动子、ef1a启动子、泛素启动子、β-actin启动子、pgk1启动子、rosa26启动子、hsp70启动子、gapdh启动子、eif4a1启动子、egr1启动子、ferh启动子、sm22α启动子或者endothelin-1启动子。
19、在本申请的一些实施方式中，所述目标基因编码抗体、重组蛋白、多肽、酶、激素、生长因子和受体中的一种或者多种。
20、在本申请的第二方面，提供一种重组载体，其特征在于，所述载体包含：
21、a.与seq id no.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的5’同源臂，
22、b.目标基因，
23、c.与seq id no.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的3’同源臂。
24、在本申请的一些实施方式中，所述重组表达载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体、整合性噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶、整合酶底物或者质粒。
25、在本申请的第三方面，提供一种靶向整合细胞，所述靶向整合细胞包含第一方面中所述的核酸。
26、在本申请的一些实施方式中，所述靶向整合细胞为真核细胞；
27、在本申请的一些实施方式中，所述真核细胞为哺乳动物细胞；
28、在本申请的一些实施方式中，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢cho细胞、人胚肾hek293细胞。
29、在本申请的第四方面，提供第三方面所述的靶向整合细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
30、将第一方面中所述的核酸导入细胞，或者提供包含seq id no.1所示的核酸片段的细胞并将所述外源核酸片段整合至所述核酸片段，制备靶向整合细胞。
31、在本申请的第五方面，提供一种生产目标基因表达产物的方法，所述方法包括如下步骤：培养第三方面中所述的靶向整合细胞，收集所述外源核酸片段中目标基因的表达产物。
32、相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：
33、本申请经过大量的筛选，发现在宿主细胞的mtf1基因的合适位置插入外源目标基因，对应得到的靶向整合细胞均具有稳定且高产目标产物(无论是融合蛋白，双抗还是单抗)的特点。并且，所得靶向整合细胞对培养工艺要求不苛刻，自身构建工艺简单，耗时缩短，成本降低，重复性好，可控性强。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.核酸，其特征在于，所述核酸包含SEQ ID No.1所示的核酸片段，所述核酸片段内整合有外源核酸片段。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3435-3635个碱基区间内的任意位点；
3.根据权利要求1或者2所述的核酸，其特征在于，所述外源核酸片段包含：重组酶识别的第一重组识别序列和第二重组识别序列，位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的选择标记基因和目标基因，以及调控所述选择标记基因和所述目标基因表达的启动子。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述重组酶为Bxb1整合酶、ΦC31整合酶、Cre重组酶或者FLP重组酶；或/和，
5.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因和荧光蛋白基因中的一种或者多种。
6.根据权利要求3所述
7.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述目标基因编码抗体、重组蛋白、多肽、酶、激素、生长因子和受体中的一种或者多种。
8.重组载体，其特征在于，所述载体包含：
9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于，所述重组表达载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体、整合性噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶、整合酶底物或者质粒。
10.靶向整合细胞，其特征在于，所述靶向整合细胞包含权利要求1至7任一项所述的核酸。
11.根据权利要求10所述的靶向整合细胞，其特征在于，所述靶向整合细胞为真核细胞；
12.权利要求10或者11所述的靶向整合细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
13.生产目标基因表达产物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：培养权利要求10或者11所述的靶向整合细胞，收集所述外源核酸片段中目标基因的表达产物。
...【技术特征摘要】
1.核酸，其特征在于，所述核酸包含seq id no.1所示的核酸片段，所述核酸片段内整合有外源核酸片段。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第3435-3635个碱基区间内的任意位点；
3.根据权利要求1或者2所述的核酸，其特征在于，所述外源核酸片段包含：重组酶识别的第一重组识别序列和第二重组识别序列，位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的选择标记基因和目标基因，以及调控所述选择标记基因和所述目标基因表达的启动子。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述重组酶为bxb1整合酶、φc31整合酶、cre重组酶或者flp重组酶；或/和，
5.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因和荧光蛋白基因中的一种或者多种。
6.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述启动子为cmv启动子、sv40启动子、rsv启动子、β-globin启动子、ubc启动子、ef1a启动子、泛素启...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，杨小丽，邓新宇，李文峥，陈伟海，梁国龙，
申请(专利权)人：深圳太力生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。