【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种呼吸道粘膜上皮类器官感染细菌后的损伤的评估方法。
技术介绍
1、(1)气道纤毛细胞和纤毛
2、人的气道-从气管到肺泡长达23代的二分、中空管分支结构，是由大约1010个细胞组成的一层连续的假复层上皮层构成，覆盖表面积为2500平方厘米。气道上皮由四种主要细胞类型组成，它们排列在连续的基底膜上，包括纤毛细胞、分泌型细胞、未分化的中间细胞和基底细胞。纤毛细胞是气道上皮的主要细胞类型，呈柱状，向表面逐渐变细，位于基底膜上。纤毛细胞的管腔表面有运动纤毛，其由纤毛膜、基质和纤毛轴组成。纤毛轴(axoneme)是重要的骨架结构，外周由纤毛膜包裹，而纤毛基质填充在纤毛轴和纤毛膜之间。正常运动纤毛的纤毛轴呈“9×2+2”结构，包括9组双联体状的外周微管(microtubule doublets)，相邻的外周微管之间由微管连接蛋白(nexin-dynein regulatory complex，n-drc)相连，双联体外周微管分别称a管(a microtubule)和b管，相互间呈紧密连接；从a管伸出两条短臂，分别称为外动力臂(outer dynein arm，oda)和内动力臂(inner dynein arm，ida)；外周微管环绕着两条单独分开的微管结构，为中央微管(central pair)。外周微管和中央微管间由放射状的辐条结构(radial spoke)相连接。
3、(2)纤毛超微结构相关蛋白及其标志物
4、编码纤毛轴丝结构及其附属结构的基因突变可导致纤毛超微结构异
5、(3)粘液纤毛清除功能(mucociliary clearance,mcc)
6、呼吸道粘膜纤毛转运系统主要通过纤毛的摆动实现对粘液的清除，从而把吸附在粘液中的细菌、病毒等微生物、尘埃颗粒及细胞代谢坏死物排出体外或通过吞咽动作经消化道排出。mcc主要是由呼吸道粘膜纤毛柱状上皮细胞上的纤毛和杯状细胞与粘膜下腺体分泌的粘液组成。影响mcc的因素如下：
7、其一，纤毛因素。①纤毛的超微结构：纤毛的运动是依靠动力蛋白水解atp，分解atp后动力蛋白臂附着于相邻的双联微管，使微管之间产生位移或滑动，导致纤毛整体的运动。每秒钟纤毛摆动的次数称为纤毛摆动频率(cbf)。纤毛超微结构改变如动力臂缺陷、辐射状缺陷、微管数量改变或移位、复合纤毛、巨大纤毛、胞质纤毛、纤毛膜水疱等，将使纤毛cbf下降或摆动不协调，从而使mcc下降。②纤毛摆动方向：正常的mcc要求纤毛的摆动方向一致。若摆动方向紊乱，即使cbf正常仍有mcc障碍。③纤毛长度：mcc障碍与纤毛缩短有关。④呼吸道上皮的纤毛化程度：正常呼吸道上皮被浓密的纤毛所覆盖，在一些疾病中，纤毛柱状上皮细胞减少而被鳞状细胞取代，或纤毛上皮细胞上纤毛脱落、减少，使呼吸道上皮纤毛化程度下降，导致mcc障碍。⑤纤毛波形：正常纤毛运动的波形是协调一致的，呈波浪式运动。异常的纤毛运动波形和异常的mcc相联系。
8、其二，粘液因素。粘液主要由水分(＞95％)、电解质(1％)、粘液蛋白(0.5％-1％)等组成，病理状态下可含有脂质和dna。粘液蛋白不仅使粘液具有一定的粘性，而且因其分子交联而具有一定的弹性，二者决定粘液的基本性质，其中弹性对粘液排出的影响更为重要。正常呼吸道mcc除要求粘液具有一定的粘性和弹性外，还要求其具有一定的厚度。
9、除纤毛和粘液因素外，mcc还受环境因素如温度、湿度、酸碱度、氧供情况和一些化学物质影响，年龄、性别、体位、睡眠、运动等生理因素也有一定的影响。mcc是重要的呼吸道清除防御机制之一，对于粘液、吸入颗粒、病原微生物的清除方面具有重要作用，同时具有机械、化学和生物屏障作用。
10、(4)细菌感染与呼吸道纤毛
11、呼吸道纤毛是宿主和吸入病原体之间的最早接触点之一。慢性呼吸道疾病(chronic respiratory disease，crd)患者在病原体入侵及其他有害因素影响下，呼吸道粘膜上皮化生、脱落，导致纤毛柱状上皮细胞减少，从而使上皮纤毛化程度下降，是影响mcc的一大因素。同时，crd患者因其呼吸道粘膜反复慢性炎症，导致呼吸道上皮基膜、纤毛柱状上皮细胞纤毛发生改变，可出现纤毛膜增厚、纤毛肿胀、复合纤毛形成、微管移位、辐射状缺陷。当crd患者急性加重时中性粒细胞刺激粘膜下腺体呈高分泌，使外周呼吸道形成粘液栓。粘液主要由杯状细胞分泌，crd患者因呼吸道上皮化生，导致杯状细胞数量增加；在急性加重期，通过炎症细胞因子il-8、ltb4、tnf-a等的作用，中性粒细胞聚集到炎症部位，在细胞表面产生弹性酶，从而刺激杯状细胞脱颗粒和粘液高分泌，导致呼吸道内粘液数量增多，粘液糖蛋白及组织渗出的蛋白质含量增高，则粘液增加而排出困难，从而导致呼吸道mcc障碍。
12、正常呼吸道具有完善的防御功能，对吸入空气具有过滤、加温和湿化作用；气管、支气管粘膜-纤毛运动及咳嗽反射等，都能净化和清除异物和微生物。因此，正常情况下，下呼吸道始终能保持无菌状态。细菌感染是慢性呼吸道疾病发生的一个重要因素，最常见的细菌感染是流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、摩拉菌属。mcc障碍和局部免疫功能下降，为慢性呼吸道疾病发生提供了内在条件，使细菌等微生物在下呼吸道寄居。这些病原微生物及其产物通过增强粘液分泌、直接或间接损害纤毛活性，从而促使mcc进一步障碍；而此过程又更诱发了病原微生物在局部克隆、繁殖，促使crd患者急性发作，形成恶性循环，导致慢性呼吸道疾病进一步发展、恶化。
13、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种呼吸道粘膜上皮类器官感染细菌后的损伤的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，检测所述类器官感染模型的纤毛相关基因的表达，以评估所述呼吸道粘膜上皮类器官的损伤情况；其中，所述纤毛相关基因包括纤毛超微结构相关基因，所述纤毛超微结构相关基因包括如下基因中的至少一种：DNAH5、DNAH9、DNAL1、RSPH4A、RSPH1、RSPH9、GAS8。
3.根据权利要求2所述的评估方法，其特征在于，所述检测所述类器官感染模型的纤毛相关基因的表达，以评估所述呼吸道粘膜上皮类器官的损伤的步骤包括：
4.根据权利要求2-3任一项所述的评估方法，其特征在于，采用荧光定量PCR检测所述纤毛相关基因的表达；
5.根据权利要求4所述的评估方法，其特征在于，荧光定量PCR检测所用的内参基因为18S rRNA，采用序列如SEQ ID No.15-SEQ ID No.16所示的扩增引物对对所述内参基因进行PCR扩增。
6.根据权利要求2所述的评估方法，其特征在于，采用免疫荧光技术检测所述类器官感染
7.根据权利要求6所述的评估方法，其特征在于，采用免疫荧光技术检测所述类器官感染模型的DNAH5和RSPH4A的蛋白表达。
8.根据权利要求1-3、5-7任一项所述的评估方法，其特征在于，采用苏木精-伊红染色法检测所述类器官感染模型的组织破坏程度，以评估所述呼吸道粘膜上皮类器官的损伤情况；
9.根据权利要求1-3、5-7任一项所述的评估方法，其特征在于，所述呼吸道粘膜上皮类器官为鼻粘膜上皮类器官。
10.根据权利要求1-3、5-7任一项所述的评估方法，其特征在于，所述细菌包括流感嗜血杆菌。
...【技术特征摘要】
1.一种呼吸道粘膜上皮类器官感染细菌后的损伤的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，检测所述类器官感染模型的纤毛相关基因的表达，以评估所述呼吸道粘膜上皮类器官的损伤情况；其中，所述纤毛相关基因包括纤毛超微结构相关基因，所述纤毛超微结构相关基因包括如下基因中的至少一种：dnah5、dnah9、dnal1、rsph4a、rsph1、rsph9、gas8。
3.根据权利要求2所述的评估方法，其特征在于，所述检测所述类器官感染模型的纤毛相关基因的表达，以评估所述呼吸道粘膜上皮类器官的损伤的步骤包括：
4.根据权利要求2-3任一项所述的评估方法，其特征在于，采用荧光定量pcr检测所述纤毛相关基因的表达；
5.根据权利要求4所述的评估方法，其特征在于，荧光定量pcr检测所用的内参基因为18s r...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄妍虹，李亮，卫青，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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