一种利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CAR-T细胞的TIGIT基因进行敲除的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CAR‑T细胞的TIGIT基因进行敲除的方法和应用。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CAR‑T细胞的TIGIT进行敲除，设计出TIGIT敲除的CAR‑T细胞（简称为△TIGIT‑CAR‑T），该CAR‑T细胞由于不表达TIGIT而避免受肿瘤微环境中TIGIT配体诱导的T细胞免疫抑制，因而能够维持CAR‑T细胞持久的抗肿瘤活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞免疫治疗，具体涉及一种利用crispr/cas9基因编辑技术对car-t细胞的tigit基因进行敲除的方法和应用。

技术介绍

1、嵌合抗原受体t细胞（chimeric antigen receptor t cell, car-t）是一种是使用基因工程技术对t细胞进行改造的疗法，该疗法通过将抗体的抗原结合区域即单链抗体可变区（single-chain fragment variable, scfv）与t细胞受体进行融合，形成嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, car），进一步通过病毒载体等方法将car基因转入t细胞制备形成car-t细胞。car-t细胞通过其scfv结构特异性识别肿瘤抗原，在car-t细胞的胞内外不同结构域的共同作用下，在识别特定抗原后可越过mhc的提呈机制而直接被激活，对肿瘤细胞发挥强烈的杀伤作用。

2、近年来， car-t细胞疗法作为一种创新性的癌症治疗手段，已在临床上取得显著成功。然而，其长期疗效受到t细胞抑制分子的负面调控，其中tigit作为一种关键的抑制因子，严重制约了c本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.特异性靶向CAR-T细胞的TIGIT的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列SEQIDNO.1所示。

2.一种利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CAR-T细胞的TIGIT基因进行敲除的方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）电击转染的条件是：570 V、20 ms。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA和Cas9蛋白的质量比为：5:1。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）孵育时间为15 min。

6.根据权利要求2所述的方法...

【技术特征摘要】

1.特异性靶向car-t细胞的tigit的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列seqidno.1所示。

2.一种利用crispr/cas9基因编辑技术对car-t细胞的tigit基因进行敲除的方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）电击转染的条件是：570 v、20 ms。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgrna和cas9蛋白的质量比为：5:1。

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【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽娟，夏园，沈旭星，朱剑锋，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：