【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及仿生细胞领域，具体涉及一种表达cxcr4的仿生载药纳米粒子及其制备方法和应用。
技术介绍
1、间充质干细胞(mscs)因其低免疫原性及广谱的免疫调节功能，已被广泛应用于各类疾病的临床治疗中。mscs得益于细胞膜上的主要组织相容性复合体i类分子、ii类分子和共刺激分子的表达缺失或低表达，使其具有天然的低免疫原性，这允许它们进入机体后能够躲避机体免疫细胞的清除，延长血液循环时间。近年来，以干细胞为基础的“载体干细胞”的研究逐渐进入人们的视野。mscs表达许多受体和细胞粘附分子，能够帮助其迁移和归巢到目标组织。其中膜趋化因子受体cxcr4与炎症损伤部位高浓度的基质来源因子-1(sdf-1)组成的cxcr4/sdf-1信号轴是mscs趋化归巢最主要的机制之一。这是干细胞运输纳米颗粒进行肿瘤及炎症性疾病靶向治疗的基础。sdf-1/cxcr4轴发生失调在骨髓间充质干细胞的分化、迁移、募集和移植以及存活和增殖中起着关键作用。
2、虽然干细胞载药系统可提高纳米药物的环境适应性，但mscs本身微尺寸也限制了其精确归巢于靶组织器官，多项研究表面静脉输注的mscs多分布于肺、肝脏和脾脏中。此外，mscs向损伤组织迁移和归巢受到多种因素的影响，包括细胞的年龄和传代数量、培养条件和传递方式等。这些都限制着mscs运输载体在生物医学领域的应用。
3、目前，免疫抑制剂主要用于器官移植抗排斥、自身免疫性疾病及恶性肿瘤。但患者对高剂量免疫抑制剂存在较大的毒副反应，而低剂量的治疗又严重制约疗效。纳米药物递送系统的设计能够增溶药
技术实现思路
1、本专利技术为解决传统纳米药物治疗自身免疫性疾病归巢率低、毒副作用大、治疗效果不稳定等问题，提供一种表达cxcr4的仿生载药纳米粒子及其制备方法和应用，利用具有优异生物相容性并可降解的纳米材料负载免疫抑制剂制备得到纳米药物，将过表达cxcr4的间充质干细胞膜包被于纳米药物表面，进一步协同干细胞的免疫逃逸和炎症趋化功能，制备得到细胞膜包被的仿生纳米药物，改善药物体内分布，降低免疫抑制药物的毒副作用，从而实现药物高效、靶向病变部位递送的有效策略。
2、一种表达cxcr4的仿生载药纳米粒子的制备方法，包括：
3、将乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂按一定比例混合，采用微流控技术制备成载药纳米颗粒；
4、制备稳定表达cxcr4膜蛋白的msc细胞，使其裂解提出细胞膜，得到工程化干细胞膜；
5、将工程化干细胞膜与载药纳米颗粒融合，得到表达cxcr4的仿生载药纳米粒子，所述的表达cxcr4的仿生载药纳米粒子为具有趋化性能的仿生细胞膜载药纳米颗粒；
6、其中，工程化干细胞膜与载药纳米颗粒融合的方法为：使工程化干细胞膜与载药纳米颗粒按质量比0.8～1:0.8～1共混，通过超声融合，其中超声处理频率为10～30khz，时间为30～60s，温度为5～10℃。
7、为优化上述技术方案，采取的具体措施/限定还包括：
8、所述的免疫抑制剂选自环孢素、甲氨蝶呤和环磷酰胺中的至少一种。
9、乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂按质量比5～10:1混合。
10、采用微流控技术制备成载药纳米颗粒的具体方法为：将乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂混合并溶于二甲基亚砜成为水相混合物，乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂与二甲基亚砜的质量/体积比为5-15:1mg/ml，使水相混合物逐滴滴入超纯水中，超纯水与水相混合物的体积比为6～10:1，并在室温下搅拌0.5～3h。
11、载药纳米颗粒纯化：制备的载药纳米颗粒转移到透析袋中以去除多余的有机相和试剂，通过蒸馏去除水和水透析30h后，将悬浮液冷冻干燥，得到纯化后的纳米粒子。滤膜的截留分子量为3～7kda。
12、所述的msc细胞选自人脐带msc细胞、人脂肪msc细胞或人骨髓msc细胞中的至少一种。
13、稳定表达cxcr4膜蛋白的msc细胞的制备方法为：将p3代的msc细胞培养至融合达80～90％，使用含lv-cxcr4过表达慢病毒的培养基对msc细胞进行转染，在37℃培养12～24h，用dmem培养基替换含有lv-cxcr4过表达慢病毒的培养基继续培养36～48h，随后进行抗性筛选，得到稳定表达cxcr4膜蛋白的msc细胞。
14、使其裂解提出细胞膜，得到工程化干细胞膜的方法为：用预冷的磷酸盐缓冲液溶液冲洗细胞两到三次之后，用低渗裂解液重悬后，置于液氮中反复冻融4～5次使细胞充分裂解，离心提出细胞膜沉淀，用磷酸缓冲盐溶液重悬，在聚碳酸酯膜中反复挤出8～13次，得到工程化干细胞膜。聚碳酸酯膜孔径为400nm、200nm或100nm，优选为200nm。
15、低渗裂解液包括tris-hcl缓冲溶液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
16、本专利技术还保护所述方法制备的表达cxcr4的仿生载药纳米粒子。
17、本专利技术还保护所述的仿生载药纳米粒子在制备免疫抑制剂药物中的应用。
18、进一步地，所述的应用为仿生载药纳米粒子在制备类风湿性关节炎递送药物中的应用。
19、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
20、本专利技术将趋化减弱的体外2d培养干细胞进行改造，使其能够“归巢”到炎症损伤或肿瘤微环境，分离出的cxcr4干细胞膜用于包裹临床治疗药物，得到的仿生细胞膜载药纳米颗粒能够向体内受损部位定向迁移并靶向到特定细胞。
21、本专利技术首先分析了msc细胞膜特征，结合生物材料性质、通过基因工程技术构建出过表达cxcr4的干细胞，采用纳米沉淀法制备plga载药纳米粒子，包裹cxcr4干细胞膜形成仿生纳米药物，实现仿生膜包裹纳米药物系统性递送到损伤部位，缓解病程，方法简单，操作方便。
22、本专利技术工程化干细胞膜与载药纳米颗粒融合和微流控技术制备载药纳米颗粒的方法对产物cmpns的成功获取及产物性能的影响较为关键，采用本专利技术中的工艺方法能够达到较理想的实验效果。
23、经进一步研究发现，本专利技术工程化的msc高表达cxcr4使细胞获得更强的迁移能力，共培养的炎症细胞的比例降低；因此，在疾病进展期注入工程化的mscs膜包裹的纳米药物，仿生纳米粒向受损脏器的定向迁移、免疫调节能力增强，有利于进一步改善msc仿生膜的疾病治疗效果。
24、本专利技术还提供了其相关医学制药应用，如器官移植抗排斥、自身免疫性疾病和恶性肿瘤治疗，缓解了纳米药物系统性毒性的问题，同时确保了携载的治疗药物在损伤部位长时间存活并稳定发挥生物功能，使免疫抑制药物可以在体内达到治疗最小剂量。
25、本专利技术对仿本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达CXCR4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的表达CXCR4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述的免疫抑制剂选自环孢素、甲氨蝶呤和环磷酰胺中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的表达CXCR4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂按质量比5～10:1混合。
4.根据权利要求1所述的表达CXCR4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：采用微流控技术制备成载药纳米颗粒的具体方法为：将乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂混合并溶于二甲基亚砜成为水相混合物，乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂与二甲基亚砜的质量/体积比为5-15:1mg/mL，使水相混合物逐滴滴入超纯水中，超纯水与水相混合物的体积比为6～10:1，并在室温下搅拌0.5～3h。
5.根据权利要求1所述的表达CXCR4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述的MSC细胞选自人脐带MSC细胞、人脂肪MSC细胞或人骨髓MSC细胞中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的表达C
7.根据权利要求1所述的表达CXCR4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：使其裂解提出细胞膜，得到工程化干细胞膜的方法为：用预冷的磷酸盐缓冲液溶液冲洗细胞，用低渗裂解液重悬后，置于液氮中反复冻融使细胞充分裂解，离心提出细胞膜沉淀，用磷酸缓冲盐溶液重悬，反复挤出，得到工程化干细胞膜。
8.权利要求1-7任一项所述方法制备的表达CXCR4的仿生载药纳米粒子。
9.权利要求8所述的仿生载药纳米粒子在制备免疫抑制剂药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：仿生载药纳米粒子在制备类风湿性关节炎递送药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种表达cxcr4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的表达cxcr4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述的免疫抑制剂选自环孢素、甲氨蝶呤和环磷酰胺中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的表达cxcr4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂按质量比5～10:1混合。
4.根据权利要求1所述的表达cxcr4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：采用微流控技术制备成载药纳米颗粒的具体方法为：将乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂混合并溶于二甲基亚砜成为水相混合物，乳酸-羟基乙酸共聚物和免疫抑制剂与二甲基亚砜的质量/体积比为5-15:1mg/ml，使水相混合物逐滴滴入超纯水中，超纯水与水相混合物的体积比为6～10:1，并在室温下搅拌0.5～3h。
5.根据权利要求1所述的表达cxcr4的仿生载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述的msc细胞选自人脐带msc细胞、人脂肪msc细胞或人骨髓msc细胞中的至少一种。
...【专利技术属性】
技术研发人员：孙凌云，甘璟璟，赵远锦，张大淦，车俊怡，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：
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