【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学领域，具体而言，本专利技术涉及同时靶向整合素α4β7和tnf-α的双特异性抗体，编码它们的核酸分子、载体及宿主细胞，所述双特异性抗体的衍生物，以及它们用于疾病治疗的用途。
技术介绍
0、技术背景
1、炎症性肠病(inflammatory bowel disease,ibd)是一种累及回肠、直肠、结肠的特发性慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,uc)和克罗恩病(crohn’s disease,cd)。ibd是由易感基因、不利环境和免疫系统功能紊乱等多因素共同导致的过度活跃的炎症反应，黏膜屏障受损和管腔菌群紊乱最终导致肠道免疫系统的连续失调。目前针对ibd的治疗措施旨在调节炎症反应，以减轻肠道炎症，促进黏膜愈合。早期非生物疗法如氨基水杨酸盐、硫嘌呤和类固醇等小分子药物可缓解炎症性肠病的症状，但不会改变整个病程的发展，且副作用明确。近年来炎症性肠病的治疗目标已经从症状控制转向逆转病程发展，越来越多的ibd患者寻求生物制剂的有效治疗，其中尤以anti-tnf-α和anti-α4β7单抗生物制剂应用最为广泛。
2、英夫利昔单抗(infliximab)是首个用于治疗ibd的单克隆抗体，是一种嵌合型免疫球蛋白，通过抑制tnf-α的功能活性发挥作用，治疗后的结肠活检组织学评估显示tnf-α显著降低。此外，英夫利昔单抗能够有效降低约三分之二中重度cd患者的急性发作频率，在维持缓解和预防cd相关肠瘘复发方面具有有效性。其他靶向抑制tnf-α的单克隆抗体包括阿达木
3、由于现有传统抗体生物制剂存在组织穿透性差、免疫原性强等问题，造成患部药物浓度低于治疗浓度并导致二次应答缺失，从而影响持续疗效。目前单用这些制剂均存在无响应、获得性耐药几乎无法避免等问题。最新临床实验证明联合使用抗tnf-α(ada/ifx)和抗整合素α4β7(vdz)生物制剂能够使患者得到更好的临床缓解和粘膜修复，目前尚未有一块同时靶向tnf-α和整合素α4β7的生物制剂，而序贯治疗的不良反应、生物安全及药代动力学是难以评估的。
4、早期的双特异性抗体(bispecific antibody,bsab)制备是将两种单克隆抗体进行融合，方法主要有化学偶联法、双杂交瘤细胞法。随着抗体工程技术尤其是噬菌体展示技术的发展，双特异性抗体的开发迎来了新的契机。近期，第四个bsab药物amivantamab也获fda准上市，用于非小细胞肺癌的治疗。由于癌症和其他疾病均是由多因素导致的，在病原学上有许多信号通路，单一靶点的免疫治疗不能有效杀死靶向细胞。接受mab治疗的患者可能会产生抗药性或对治疗无应答。因此，bsab已成为癌症、炎症、病毒感染及自身免疫病等许多疾病治疗的主要选择。随着双特异性抗体双靶点治疗技术的发展和完善，不同疾病的诊断和治疗在发展中不断得到改善，双特异性纳米抗体(bispecific nanobody,bsnb)的应用丰富了治疗方法并延续了纳米抗体分子量小、组织穿透、特异性强和对表位的深层靶向等优势，对这三个领域疾病的诊断和治疗研究者们有了更多的发现和突破。
5、纳米抗体具有高水溶性、高稳定性、组织穿透力强、高抗原结合活性和低免疫原性等优点。因其免疫原性弱、结构稳定、易人源化等特点，在肿瘤、炎症等疾病的诊疗方面具有广阔的应用前景。基于现有ibd治疗生物制剂的局限性，小型化、人源化、理性设计优化的抗体药物的开发和应用是今后ibd治疗的发展方向，基于纳米抗体的tnf-α和整合素α4β7双靶向生物制剂的开发，可能为打破ibd现有治疗天花板提供新的可能。
技术实现思路
1、本申请的专利技术人基于通过噬菌体表面展示技术筛选出具备优良性能的抗整合素α4β7纳米抗体，基于此进一步提供了了同时靶向整合素α4β7和tnf-α的双特异性抗体(例如双特异性纳米抗体)，其能够有效抑制α4β7和tnf-α的生物活性，抑制炎症反应。由此提供了以下方面。
2、双特异性抗体
3、在一个方面，本专利技术提供了一种特异性结合整合素α4β7和tnf-α的双特异性抗体，其包含对整合素α4β7特异性的第一抗原结合结构域和对tnf-α特异性的第二抗原结合结构域。
4、α4β7结合结构域
5、本专利技术的双特异性抗体所包含的对整合素α4β7特异性的第一抗原结合结构域为vhh，其包含：
6、(i)如seq id no:5所示的cdr1、如seq id no:6所示的cdr2以及如seq id no:7所示的cdr3；优选地，所述cdr1、cdr2和cdr3通过kabat编号系统确定；或，
7、(ii)seq id no:1所示的vhh中含有的cdr1、cdr2以及cdr3；优选地，所述cdr由chothia、kabat或imgt编号系统定义。
8、在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域进一步包含源自驼源重链抗体的框架区。
9、在另一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域进一步包含源自人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。
10、在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含如seq id no:1或其变体所示的vhh序列；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；在某些实施方案中，所述置换是保守置换。
11、在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含如seq id no:1所示的vhh序列。
12、tnf-α结合结构域
13、本专利技术的双特异性抗体所包含的对tnf-α特异性的第二抗原结合结构域可以为任何抗体形式。
14、在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域选自纳米抗体、全长抗体(例如igg抗体)或其抗原结合片段(例如scfv、fab、scfab)。
15、在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域为vhh。
16、在某些实施方案中，所述vhh包含：
17、(i)如seq id no:8本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性结合整合素α4β7和TNF-α的双特异性抗体，其包含对整合素α4β7特异性的第一抗原结合结构域和对TNF-α特异性的第二抗原结合结构域，其中，所述第一抗原结合结构域为VHH，其包含如SEQ ID NO:5所示的CDR1、如SEQ ID NO:6所示的CDR2以及如SEQ IDNO:7所示的CDR3；
2.权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第二抗原结合结构域是VHH；
3.权利要求2所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域任选地通过接头连接；
4.权利要求2或3所述的双特异性抗体，其进一步包含免疫球蛋白Fc结构域；
5.权利要求2-4任一项所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包含如SEQ IDNO:11所示的序列。
6.多特异性抗体，其包含权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体；
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体或权利要求6所述的多特异性抗体。
8.载体，其包含权利要求7所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或
9.宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的载体。
10.制备权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体或权利要求6所述的多特异性抗体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述双特异性抗体或多特异性抗体。
11.缀合物，其包含权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体或权利要求6所述的多特异性抗体以及偶联部分；
12.药物组合物，其包含权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体、权利要求6所述的多特异性抗体、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞、或权利要求11所述的缀合物；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
13.权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体、权利要求6所述的多特异性抗体、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞、权利要求11所述的缀合物、或权利要求12所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与整合素α4β7有关和/或与TNF-α有关的疾病；
14.用于检测整合素α4β7和/或TNF-α在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体或权利要求11所述的缀合物；
15.权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体或权利要求11所述的缀合物在制备用于检测整合素α4β7和/或TNF-α在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与整合素α4β7有关和/或与TNF-α有关的疾病的检测试剂中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种特异性结合整合素α4β7和tnf-α的双特异性抗体，其包含对整合素α4β7特异性的第一抗原结合结构域和对tnf-α特异性的第二抗原结合结构域，其中，所述第一抗原结合结构域为vhh，其包含如seq id no:5所示的cdr1、如seq id no:6所示的cdr2以及如seq idno:7所示的cdr3；
2.权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第二抗原结合结构域是vhh；
3.权利要求2所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域任选地通过接头连接；
4.权利要求2或3所述的双特异性抗体，其进一步包含免疫球蛋白fc结构域；
5.权利要求2-4任一项所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包含如seq idno:11所示的序列。
6.多特异性抗体，其包含权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体；
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体或权利要求6所述的多特异性抗体。
8.载体，其包含权利要求7所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
9.宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的载体。
10.制备权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体或权利要求6所述的多特异性抗体的方法，其包括，在允许蛋白...
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